Ephrin－A3在脂多糖处理后星形胶质细胞增殖中的表达*

2011-08-02王继先张博爱

中国病理生理杂志 2011年9期

王继先，张博爱，刘宇，何昕，李林，张勤

(郑州大学第一附属医院神经内科，河南郑州 450052)

中枢神经系统损伤后再生困难，其机制尚不完全明确，药物应用及康复训练等只能改善而不能完全恢复其原有功能，给社会、家庭及个人造成沉重负担，因此研究损伤后细胞反应及分子变化非常重要。研究表明Eph/ephrin在神经系统中发挥重要作用，不仅参与神经系统早期的形态发生、发展及功能塑造，还参与调节成年期突触可塑性以及中枢神经系统损伤后反应[1]。星形胶质细胞(astrocyte，AS)约占中枢神经系统细胞总数的90%，它不仅仅是一种营养支持细胞，还在突触形成及功能的控制、成体神经发育、信息交流、脑血流的调控、免疫调节[2]、检测神经元活力和释放化学递质调控神经元[3]等方面起重要作用，多年来的研究显示中枢神经系统损伤、神经系统退行性病变等与炎症有密切关系，而炎症反应可以激活AS。该实验通过脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)诱导大鼠大脑皮层AS建立炎症模型，观察ephrin－A3在AS增殖中的表达变化，进一步探讨其在中枢神经系统损伤修复中的分子机制。

材料和方法

1 材料

1.1 主要试剂 DMEM培养基购自Hyclone。胎牛血清杭州四季青公司。多聚赖氨酸、兔抗GFAP多克隆抗体购自Sigma。Ephrin－A3多克隆抗体(Santa Cruz)，吖啶橙(acridine orange，AO)∕嗅化乙啶(ethidium bromide，EB)荧光试剂盒、MTT试剂盒及CY3荧光试剂盒购自碧云天生物技术研究所。抗肿瘤坏死因子 α(tumor necrosis factor α，TNF － α)酶联免疫吸附试剂盒、白细胞介素6(interleukin，IL－6)酶联免疫吸附试剂盒购自武汉博士德生物制品公司。其它生化试剂均为进口分装或国产分析纯。

1.2 动物 SPF级健康新生(24 h内)Wistar大鼠，雌雄不限，由郑州大学医学院实验动物中心提供。

2 方法

2.1 原代大鼠AS的培养、纯化和鉴定取新生24 h内的 Wistar大鼠，参照 McCarthy等[4]报道的方法进行细胞培养纯化。使用胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)鉴定所培养的 AS，取第3代AS(纯度＞97%)用于实验研究。

2.2 实验分组实验分为6组:空白对照组，LPS 10 mg/L作用30 min组、6 h组、24 h组、48 h组和72 h组。

2.3 AS形态学观察应用倒置相差显微镜观察AS的生长情况及形态变化。

2.4 MTT法测定AS存活率使用96孔培养板，每孔接种1×104细胞，置37℃、5%C02培养箱中培养3 d，细胞进入对数生长期后，加入LPS 100 μL(10 mg/L)，每组复孔8 个(n=8)，分别孵育30 min、6 h、24 h、48 h 和72 h 后，每孔加入 10 μL MTT 溶液，在细胞培养箱内继续孵育4 h。每孔加入100 μL formanzan溶化液，在37℃细胞培养箱内再继续孵育直至在显微镜下观察，Formazan结晶全部溶解。以空白孔调零，使用酶标仪测定570 nm波长的吸光度值(A值)。使用等量不加LPS的无血清DMEM作为对照组。

2.5 AO/EB检测AS凋亡率各组AS培养至不同时点后应用AO/EB荧光试剂盒行AO/EB染色，操作步骤按照试剂盒说明书进行。荧光显微镜下观察，可见4种细胞形态:活细胞，核染色质着绿色并呈正常结构;早期凋亡细胞，核染色质着绿色并呈固缩状或圆珠状;晚期凋亡细胞，核染色质为橘红色并呈固缩状或圆珠状;非凋亡的死亡细胞，核染色质着红色并呈正常结构。高倍镜下随机选取4个视野分类计数细胞计算细胞凋亡率，细胞凋亡率=(早期凋亡细胞+晚期凋亡细胞)∕(活细胞+非凋亡的死亡细胞+早期凋亡细胞+晚期凋亡细胞)×100%。

2.6 ephrin－A3和GFAP表达的免疫荧光测定各组星形胶质细胞培养至不同时点后以4%多聚甲醛固定，应用ephrin－A3和GFAPⅠ抗及CY3荧光试剂盒(Ⅱ抗)行染色，测定不同时点 ephrin－A3和GFAP的表达，操作步骤按照试剂盒说明书进行。含5%牛血清白蛋白(bovine serun albumin，BSA)的TBS Tx(g/L，Tris碱 2.42，NaCl 8，Triton X －1001，pH 7.6)，封闭60 min;各组分别加ephrin－A3抗体和GFAP抗体浓度为1∶100，4℃过夜;CY3标记的抗兔IgG浓度为1∶200，作用60 min;抗荧光淬灭封片液封片后荧光显微镜下观察，阳性细胞呈红色荧光。应用Image－Pro Plus 6.0专业图像分析软件分析各实验组的荧光图片单个细胞的累积A值及平均累积A值，进行统计学分析。

2.7 ELISA法测定炎症因子各组AS培养至不同时点后应用ELISA法检测TNF－α和IL－6的含量，每组样本6个。分别用TNF－α酶联免疫吸附试剂盒和IL－6酶联免疫吸附试剂盒测定，操作按说明书进行，用Bioelisa Reader ELx800测定A值，测定波长为450 nm，经标准品拟合曲线计算出具体含量，结果以pg/L表示。

3 统计学处理

用SPSS 13.0统计软件进行分析。数据以均数±标准差()表示，经方差齐性检验后，多组均数比较采用单因素方差分析(ANOVA)，组间两两比较采用最小显著性差异法(LSD法)。检验水准为α=0.05，以P＜0.05为差异有统计学意义。

结果

1 AS形态观察及鉴定

倒置相差显微镜下观察，提取的细胞在种植1 h后开始贴壁，6 h后大部分细胞可贴壁，呈椭圆形、梭形及不规则形，24 h后所有细胞均贴壁，光晕明显，并可见少数细胞伸出1－2个细微的突起，3 d后细胞数量开始增加，胞体明显增大，突起数量增多，长度增加，并可见部分突起出现分支。传至第3代时用抗GFAP抗体进行纯度鉴定，结果显示AS纯度可达97%以上，见图1A，并检测AS上是否有ephrin－A3的表达，见图1B。

Figure1.Immunochemical staining of astrocytes.A:GFAP －positive astrocytes(×200);B:ephrin－A3－positive astrocytes(×400).图1 AS免疫组化染色

2 MTT法测定AS活性

LPS(10 mg/L)作用 AS 6 h、24 h、48 h 和72 h 的细胞活性均提高，与对照组相比均有显著差异(P＜0.05)，而30 min组细胞活性与对照组相比无显著差异(P＞0.05)。30 min组、48 h组和72 h组的细胞活性与24 h组相比均有显著差异(P＜0.05)，见表1。

表1 10 mg/L LPS作用不同时点的AS吸光度值及凋亡率比较Table1.The A570value and apoptotic rate(%)of the astrocytes in 10mg/L LPS for different times()

△P＜0.05 vs control group;*P＜0.05 vs 24 h group.

Group A570(n=8) Apoptotic rate(n=4)Control 0.07 ±0.03* 18.89 ±1.40*30 min 0.07 ±0.02* 18.87 ±1.11*6 h 0.12 ±0.05△＊ 16.04 ±5.32△＊24 h 0.16 ±0.06△ 14.12 ±2.87△48 h 0.11 ±0.03△＊ 15.86 ±1.52△＊72 h 0.11 ±0.04△＊ 17.11 ±1.35△＊

3 AO/EB检测AS凋亡率

LPS(10 mg/L)作用AS 6 h、24 h、48 h 和72 h 的细胞凋亡率均下降，与对照组相比均有显著差异(P＜0.05)，而30 min组细胞凋亡率与对照组相比无显著差异(P＞0.05)。30 min组、48 h组和72 h组的细胞凋亡率与24 h组相比均有显著差异(P＜0.05)，见表1、图2。

4 ephrin－A3和GFAP表达的免疫荧光测定结果

荧光显微镜下观察发现，各组AS的胞体和突起均呈红色荧光，细胞核不显色，为一暗区。LPS作用24 h、48 h和72 h的胞体和突起的 ephrin－A3和GFAP的荧光强度显著增强，并有逐渐增强趋势，与对照组相比差异显著(P＜0.05)，而30 min组和6 h组与对照组相比变化不大(P＞0.05)，各组与24 h组相比，差异显著(P ＜0.05)，见表2、图3、4。

5 IL－6及TNF－α含量测定

LPS作用6 h内，IL－6和TNF－α含量维持在低水平，稍有增加(P＞0.05)，24 h时增加明显。与对照组相比，脂多糖作用24 h、48 h和72 h时IL－6和TNF－α含量显著升高(P＜0.05)，与24 h相比差异显著(P＜0.05)，见表3。

表2 各组AS不同时点ephrin－A3和GFAP的CY3荧光染色IATable2.The IA of ephrin－A3 in astrocytes of different time point(.n=5)

△P＜0.05 vs control group;*P＜0.05 vs 24 h group.

Group ephrin－A3 GFAP Control 0.386 ±0.003* 0.419 ±0.010*30 min 0.388 ±0.004* 0.421 ±0.020*6 h 0.393 ±0.003* 0.424 ±0.010*24 h 0.439 ±0.006△ 0.507 ±0.030△48 h 0.468 ±0.004△＊ 0.540 ±0.020△＊72 h 0.507 ±0.006△＊ 0.675 ±0.040△＊

表3 各组培养液中IL－6和TNF－α含量比较Table3.Changes of IL－6 and TNF－α in culture medium of every group(.n=6)

△P＜0.05 vs control group;*P＜0.05 vs 24 h group.

Group IL－6(pg/L) TNF－α(pg/L)Control 249.1 ±20.1* 70.3 ±9.1*30 min 251.2 ±19.7* 70.8 ±6.9*6 h 278.9 ±28.5* 71.5 ±8.3*24 h 2057.8 ±47.6△ 79.1 ±7.6△48 h 2374.6 ±38.5△＊ 98.5 ±7.4△＊72 h 2486.3 ±35.7△＊ 101.7 ±6.5△＊

Figure2.AO/EB fluorescein staining of AS in every group(×200).A:control group;B:30min group;C:6h group;D:24 h group;E:48 h group;F:72 h group.图2 各组AS不同时点AO/EB荧光染色

讨论

中枢神经系统损伤后无法恢复原有功能的主要原因是轴突再生障碍，是由多因素共同作用的结果，包括缺乏轴突生长和导向的生长促进因子、细胞微环境的抑制性改变以及轴突导向分子的参与等。

以往研究表明EphA4广泛分布于大脑神经元上，特别是海马锥体神经元的树突棘上，在应答中枢神经系统损伤的分子机制中表达上调，且起负向调控作用[5]。而ephrin－A3是EphA4的关键配体，定位于AS环绕树突棘部分的ephrin－A3对维持和活化树突棘的正常形态起着重要作用，其与树突棘结合后激活EphA4，而EphA4的活化可以缩短树突棘的长度和降低树突棘的密度，从而起到负向调控作用[6]。所以本实验选择ephrin－A3作为一个切入点研究。

Figure3.Fluorescein staining of ephrin－A3 with CY3 in AS of every group(×200).A:control group;B:30 min group;C:6 h group;D:24 h group;E:48 h group;F:72 h group.图3 各组AS不同时点ephrin－A3 CY3荧光染色

中枢神经系统损伤或发生神经退行性疾病后，炎症反应非常明显，AS被激活，产生一系列炎症因子、趋化因子和营养因子等，在神经元的发育和存活、轴突的再生、神经干细胞的分化等过程中发挥重要作用。LPS是最常用最经典的致炎剂，多被用来制作神经细胞的炎症损伤模型[7]。本实验通过LPS诱导AS建立炎症模型，检测培养液中炎症因子变化，发现AS培养液内IL－6和TNF－α显著增加、AS凋亡减少、存活增加及特异性蛋白GFAP表达增加，说明LPS在一定时间内可以促进AS分泌炎症因子，促进AS活化增殖。实验表明LPS可以激活炎症通路促进 AS分泌 IL－6、IL－8、TNF－α、一氧化氮(nitric oxide，NO)、炎症因子 10(inflammatory factor 10，IP10)、活性氧簇(reactiveoxygenspecies，ROS)等炎症因子[7]，并促进AS活化增殖[8]。这些研究结果与本实验相符，都表明炎症因子在AS增殖中起重要作用。

Figure4.Fluorescein staining of GFAP with CY3 in AS of every group(×200).A:control group;B:30 min group;C:6h group;D:24 h group;E:48 h group;F:72 h group.图4 各组AS不同时点GFAP CY3荧光染色

Eph受体酪氨酸家族及其配体ephrins是一种轴突导向分子家族，其在成年中枢神经系统中通常低水平表达，当神经系统损伤如AS、神经元和少突胶质细胞活化时出现上调，表达上调直接抑制轴突再生，另外，Eph表达也可以调控AS增生和胶质疤痕形成[9]，还有研究表明Eph可通过调控AS骨架蛋白重组从而调控其反应性[10]。结合本实验测定ephrin－A3，发现其随着GFAP增加有上调趋势，说明其可能与细胞增殖有关，综合上述实验表明Eph家族可能在AS增殖中发挥重要作用。

损伤后炎症反应可能改变Ephs和ephrins表达，研究发现:白细胞抑制因子(LIF)和IFN－γ可上调AS EphA4蛋白表达，体外细胞培养时EphA4基因敲除的AS对炎症因子如LIF或IFN－γ无反应，而海马损伤后，反应性胶质细胞(IFN－γ)受体mRNA表达上调的同时胶质ephrin－B1表达也升高[11]，在多发性硬化 (multiple sclerosis，MS)疾病中，当急性炎症脱髓鞘发生时AS Eph/ephrin在损伤活化处表达上调，而在慢性脱髓鞘非活化处炎症因子信号下降或消失，这一现象支持炎症因子与Ephs及ephrins表达上调有关[12]。本实验ephrin－A3表达上调的同时，AS培养液内的IL－6和TNF－α增加，说明两者之间存在一定关系，但其中谁是起始因素不能确定。

细胞因子信号也是调控胶质增殖的关键因素，它可引起AS EphA4表达增加，而后Rho激酶通路激活，而LIF不能引起EphA4基因敲除AS反应性增殖则表明LIF介导的胶质活化可能需通过EphA4受体信号途径起作用。实验表明Rho激酶信号可促进AS增殖[13]，Eph－Rho通路可能是星形胶质细胞增殖的起始物。本实验初步观察到ephrin－A3表达变化与AS增殖及炎症因子之间存在联系，但炎症反应、Eph/ephrin家族表达变化和AS反应性是否有直接关系尚不完全清楚，需要进一步深入研究。

体外实验表明ephrins在各种细胞轴突再生中起抑制作用，如ephrin－A5－Fc可抑制EphA4受体阳性的大鼠胚胎腹侧脊髓神经元轴突发生，ephrin－A5作用于视网膜神经节细胞和ephrin－B3作用于皮层神经元均可抑制轴突发生[14]。半定量法测定ephrins mRNA在传入神经阻滞的海马中的表达，发现多种ephrins mRNA表达上调包括ephrin－A3，有研究显示在MS中的反应性AS中ephrin－A3上调[12]。这些说明ephrin－A3可能参与成年脑中枢神经损伤后的再生及可塑性调节，且在其中可能起负向调控作用。所以，Eph/ephrin信号可能不止通过一种机制抑制轴突再生，它在成年中枢神经系统损伤后的结果中起关键作用。

综上可知，无论是ephrin－A3表达上调、AS增殖还是炎症反应，其最终的结果都可能在中枢神经系统损伤修复中起负向作用，另外，研究已经证实，ephrinB/EphB信号系统可以调节树突棘形态发生和可塑性，在含有失活EphB2体外培养的海马神经元中，树突棘无法成熟，其逆向传导对树突棘形成也很重要[15]。可见ephrin/Eph在中枢神经系统中占据了重要地位。通过对ephrin/Eph的调控，可能对脑卒中等中枢神经系统的治疗和康复产生重要影响。

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