环孢菌素A对大鼠腹主动脉球囊损伤后内膜增生的抑制作用*

熊龙根，黎德恩，董 颀

(1广州医学院第二附属医院心血管内科，广州心血管疾病研究所，广东 广州 510260;2广州医学院生理教研室，广东 广州 510182)

冠状动脉内支架置入术是冠心病介入治疗的一个重大进展，可通过抑制血管的弹性回缩，预防晚期血管重塑，使经皮冠状动脉介入治疗(percutaneous coronary intervention，PCI)后再狭窄率降低20% －30%[1]。但支架术必然会引起内膜损伤导致炎症反应。炎症细胞所释放的各种生长因子和细胞因子的产生，导致血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)增生、基质分泌，VSMCs向内膜迁移，使内膜过度增生，内膜增厚，导致再狭窄的发生，因此，VSMCs迁移及增殖是目前再狭窄形成的关键。

研究表明，钙(Ca2+)/钙调素(calmodulin，CaM)－钙调神经磷酸酶(calcineurin，CaN)－活化T细胞核因子(nuclear factors of activated T －cells，NFATc)信号系统在VSMCs迁移及增殖中起作用[2]，该信号系统可能参与支架术后再狭窄的形成。以往研究报道多以离体培养的VSMCs作为观察对象，发现抑制该通路可减少细胞的分化增殖[2，3]。但在球囊损伤后再狭窄动物模型中是否有作用，目前还未见报道。本实验拟通过观察CaN特异性抑制剂环孢菌素A对大鼠腹主动脉球囊损伤后内膜增殖的影响，为再狭窄的防治提供新的思路。

材料和方法

1 动物模型的建立与分组

将36只体重350－450 g、10－12周的雄性 SD大鼠(购自广东省实验动物监测所)随机分为假手术组(n=12)、球囊损伤组(n=12)和环孢菌素治疗组(n=12)。参照石永英等[4]的方法制作大鼠腹主动脉损伤模型，用3%戊巴比妥钠溶液按50 mg/kg腹腔注射麻醉。球囊损伤组和环孢菌素治疗组大鼠仰卧固定手术台上，沿颈前正中线切开皮肤，在颈前三角区暴露左颈总动脉，结扎左颈总动脉远心端，沿颈总动脉斜行剪开一小切口，在导丝指引下将20 mm×1.5 mm PTCA球囊导管(购自雅培公司)从切口送至腹主动脉末端，以6ATM的压力充盈球囊扩张30 s，抽至负压后，间歇60 s，再次送入球囊，重复以上操作，共3次。结扎近心端的左颈总动脉，切断两结扎端之间的动脉，适量庆大霉素局部喷洒手术野，缝合切口。假手术组除不插入球囊导管外，其余操作同手术组。术中全身肝素化(100 U/kg)，术后每天庆大霉素1.5 mg/kg腹腔注射以预防感染，共3 d。术中球囊损伤组6只死亡，环孢菌素治疗组5只死亡，假手术组2只死亡。术后普通饲料喂养，饮水不限。通过常规病理学检测血管管腔面积、内膜厚度、内膜厚度/中膜厚度等，并与假手术组相比较，以此判断模型是否成功。

2 常规病理检查

各组大鼠均于术后30 d处死。用3%戊巴比妥钠溶液按50 mg/kg腹腔注射麻醉，麻醉后切开大鼠腹腔取损伤血管段。血管置于4%多聚甲醛中固定24 h后，脱水、透明、石蜡包埋和切片。切片厚度为5 μm，每隔100 μm取一张切片，进行HE染色。采用光学显微镜和Image－Pro Plus 6.0图像分析系统对各组HE染色切片进行图像分析。首先进行图像编辑，用鼠标准确地勾出外弹力膜、内弹力膜以及管腔轮廓，测量外弹力膜、内弹力膜以及管腔的轮廓的周长，再根据公式周长=2πr，算出各个截面的半径，逐步测算血管新生内膜厚度、中膜厚度。其中，内膜厚度=(内弹力膜周径－管腔周径)/2π，中膜厚度=(外弹力膜周径－内弹力膜周径)/2π。每张切片测3次。

3 免疫组化染色

石蜡切片(5 μm)后，用SP法(SP试剂盒购自河北博海生物工程开发有限公司)进行CaN(Ⅰ抗稀释度1∶150，CaN抗体购自Abcam)的免疫组化染色。细胞质或细胞核中出现黄色或棕褐色处为阳性信号。利用Image－Pro Plus 6.0图像分析系统，测定平均吸光度值以表示阳性产物的强度，平均值越大，其阳性反应产物表达强度越强，表明蛋白的含量越高。

4 荧光定量PCR实验

RNA提取按Trizol试剂(购自Invitrogen)说明书进行，于EP管加入1 mL Trizol试剂，用眼科剪将血管迅速剪切3 min，剪碎后充分匀浆至组织完全裂解。再经氯仿、异丙醇提取总RNA。核酸蛋白定量仪测定mRNA的A260/A280，确定其纯度。逆转录反应根据逆转录试剂盒(购自TaKaRa)要求的标准进行。荧光定量PCR中的引物，其中NFATc3由TaKaRa合成，CaN、β－actin的引物由Invitrogen合成。荧光定量PCR反应根据荧光定量PCR试剂盒(购自TaKa-Ra)说明书在ABI7500进行，反应条件如下:a.预变性:95℃ 30 s。b.PCR反应:95℃ 5 s;60℃ 34 s。c.融解曲线分析:95℃ 15 s;60℃ 60 s;95℃ 15 s。反应结束后确认real－time PCR的扩增曲线和融解曲线，记录各管的 Ct值。公式:ΔΔCt=(Ct目的基因－Ct管家基因)实验组－ (Ct目的基因－ Ct管家基因)对照组，计算相对表达量，本实验以假手术组为对照组，其余各组mRNA的相对表达量用对照组的2－ΔΔCt倍表示。CaN、NFATc3和β－actin的引物序列见表1。

表1 β－actin、CaN和NFATc3 mRNA的引物序列Table1.The primers for β － actin，CaN and NFATc3 mRNA

5 统计学处理

运用SPSS 13.0统计软件处理实验数据，数据以均数±标准差()表示，采用单因素方差分析(ANOVA)并作样本均数两两比较的Turkey检验。

结 果

1 病理形态学

HE染色镜下观察与图像分析:假手术组内膜由一层完整而连续的内皮细胞构成，各层结构正常、清晰，无明显VSMCs增殖和迁移，内膜无增厚。球囊损伤组显示管腔面积缩小，内腔面变得粗糙，中层VSMCs大量增殖，并且向内膜下迁移，可见内弹力板断裂，有显著新生内膜形成，厚度不均，胞外基质增加，无内皮细胞，内弹力板附近有大量梭形核的VSMCs，排列紊乱，局部平滑肌纵向排列，呈向内膜方向生长的趋势。环孢菌素治疗组管腔面积较单纯模型组有所扩大，内膜下仅见轻微的新生内膜，见图1。球囊损伤组、环孢菌素治疗组内膜厚度、内膜厚度/中膜厚度显著高于假手术组(P＜0.05)，而环孢菌素治疗组内膜厚度、内膜厚度/中膜厚度显著低于球囊损伤组 (P ＜0.05)，见表2。

表2 各组动物内膜增生情况Table2.Intimal hyperplasia of rat abdominal aorta in all groups(μm.)

表2 各组动物内膜增生情况Table2.Intimal hyperplasia of rat abdominal aorta in all groups(μm.)

*P ＜0.05 vs sham group;△P ＜0.05 vs balloon － injured group.I/M:intimal thickness/medial thickness.

Group n Intimal thickness Medial thickness I/M Sham 10 10.004±2.163 311.497±53.460 0.033±0.006 Balloon－injured 6 202.275±66.175* 382.310±60.455 0.519±0.103*Cyclosporine A7 70.700±21.021＊△360.065±97.774 0.200±0.062＊△treatment

Figure1.Histology of intima of abdominal aorta in rats(HE staining，×200).A:sham group;B:balloon－injured group;C:cyclosporine A treatment group.图1 大鼠腹主动脉内膜组织学检测

2 各组免疫组织化学检测结果

假手术组血管壁CaN几乎不表达。球囊损伤组血管中膜和内膜VSMCs细胞CaN表达量显著高于假手术组(P＜0.05)，大部分细胞质内可见棕黄色或棕褐色颗粒。环孢菌素组中膜和内膜VSMCs细胞表达低于球囊损伤组，见图2。环孢菌素组与假手术组CaN的平均光密度值显著低于球囊损伤组(P＜0.05)，见表 3。

3 各组血管壁CaN和NFATc3 mRNA表达量的比较

经球囊损伤后，球囊损伤组血管组织CaN及其下游NFATc3表达显著高于假手术组(P＜0.05)，而环孢菌素组CaN、NFATc3表达明显低于球囊损伤组(P＜0.05)，但较假手术组有所增加，见表4。

Figure2.CaN expression in intima of rat abdominal aorta(HE staining，×400).A:sham group;B:balloon－injured group;C:cyclosporine A treatment group.图2 大鼠腹主动脉内膜CaN表达

表3 各组免疫组织化学检测结果Table3.The results of immunohistochemistry in each group()

表3 各组免疫组织化学检测结果Table3.The results of immunohistochemistry in each group()

*P ＜0.05 vs sham group;△P ＜0.05 vs balloon － injured group.

Group n Average absorbance Sham 10 0.00712 ±0.00229 Balloon － injured 6 0.06892 ±0.01856*Cyclosporine A treatment 7 0.01610 ±0.00220△

表4 各组CaN和NFATc3 mRNA相对表达量Table4.The relative expression of CaN and NFATc3 mRNA in each group()

表4 各组CaN和NFATc3 mRNA相对表达量Table4.The relative expression of CaN and NFATc3 mRNA in each group()

*P ＜0.05 vs sham group;△P ＜0.05 vs balloon － injured group.

Group n CaN mRNA NFATc3 mRNA Sham 10 1.110 ±0.608 1.063 ±0.365 Balloon －injured 6 2.143 ±0.831* 2.076 ±0.698*Cyclosporine A treatment 7 1.146 ±0.336△ 1.071 ±0.436△

讨 论

CaN属丝/苏氨酸蛋白磷酸酶家族成员(又称蛋白磷酸酶2B，PP2B)，是迄今发现的唯一受Ca2+/钙调素(CaM)调节的丝/苏氨酸蛋白磷酸酶。CaN是由结合CaM的催化亚基(CnA)和结合Ca2+调节亚基(CnB)按1∶1的比例紧密结合而组成的异源二聚体。1979年CaN首先在牛脑内被分离纯化，其广泛分布于全身各组织细胞中，其中在神经组织及T淋巴细胞中含量特别丰富，在心脏及骨骼肌中较高表达，血管组织中亦存在CaN分布，提示CaN可能对VSMCs存在重要的生理作用。活化T细胞核因子(NFAT)是由 NFATc1、(NFAT2/c)、NFATc2(NFAT1/p)、NFATc3(NFAT4/x)、NFATc4(NFAT3)及 NFAT5等5个成员构成的核转录因子。NFAT是一类与众多信号转导途径相联系，具有广泛生理功能的转录因子，其主要是通过受体－Ca2+－CaN信号途径被激活，NFAT被激活后则从胞浆转入胞核，从而发挥其基因调控功能。NFAT的激活与VSMCs增殖与迁移有关[2，5，6]。环孢菌素 A 是 CaN 的特异性抑制剂，与胞内相应的免疫亲和蛋白质结合，使得与CnB结合的螺旋状区域向免疫亲和蛋白质一方有所偏移，从而提高了免疫亲和蛋白质－抑制剂复合物结合CaN的能力，以抑制CaN的酶活力。CaN可通过其去磷酸化作用调节Ca2+通道、影响胞内Ca2+浓度、参与VSMCs增殖等功能活动的调控，其特异性底物NFAT激活后可以传递细胞外信号而引起VSMCs核内基因转录，刺激 VSMCs增殖[7－9]。PDGF － BB 是VSMCs的促有丝分裂剂，Jabr等[10]研究发现，PDGF－BB是通过Ca2+/CaM－CaN－NFATc信号系统介导VSMCs增生。Nilsson等[11]研究发现ET－1孵育VSMCs，用免疫荧光实验发现VSMCs内NFATc3有明显的核易位，若用NFAT抑制剂A－285222和EF－1共同孵育VSMCs，则NFATc3核易位明显受抑制，从而抑制VSMCs增殖。雷尼丁是钙激动剂，杨永健等[12]发现在雷尼丁刺激的大鼠VSMCs增殖中，雷尼丁可使VSMCs中CaN活性增强，同时使VSMCs蛋白核酸合成率增加，环孢菌素A可明显抑制该作用，表明CaN信号通路在雷尼丁刺激的VSMCs增殖中发挥重要作用。本实验显示，环孢菌素A可使大鼠腹主动脉损伤后内膜增生减轻，减少再狭窄的发生。为了探讨环孢菌素A是否通过抑制CaN信号通路，从而减轻大鼠腹主动脉球囊损伤后内膜的增殖作用，本研究用免疫组织化学检测各组血管壁CaN的表达，同时用荧光定量PCR方法检测各组大鼠血管壁中CaN、NFATc3 mRNA的表达水平。结果发现环孢菌素A可以使损伤血管壁CaN蛋白、CaN mRNA和NFATc3 mRNA的表达显著减少。

本研究结果表明，Ca2+/CaM－CaN－NFATc信号系统参与了VSMCs的增殖与迁移，而环孢菌素可以抑制CaN信号通路，从而减轻大鼠腹主动脉损伤后的VSMCs的增殖，增加损伤后的管腔面积，抑制内膜增生。环孢菌素的这种作用可用于血管损伤后再狭窄的预防，为临床防止再狭窄提供实验依据。除CaN抑制剂(CsA、FK506)外，其下游NFATc可成为阻止再狭窄的作用新位点，如 VIVIT可抑制NFATc从而可减轻内膜VSMCs增殖及新生内膜形成，其优点是可提供特异性的抑制药物，避免免疫抑制等并发症发生。总之，Ca2+/CaM－CaN－NFATc信号通路在经皮冠状动脉介入治疗术后再狭窄中的作用的阐明，以及对CaN作用机制的深入研究，对进一步认识经皮冠状动脉介入治疗术后再狭窄具有重要意义，为临床经皮冠状动脉介入治疗术后再狭窄的防治新措施提供了一条新的思路。

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