补肾活血方对血管性痴呆小鼠脑组织BDNF和bFGF含量的影响

于文涛 张一昕 张 杰 (河北医科大学中医学院，河北 石家庄 05009)

血管性痴呆(VD)是因脑血管病所致的智能及认知功能障碍，为老年人常见病、多发病。补肾中药和活血中药为临床治疗VD最常用药物，具有公认的疗效〔1〕。为了比较不同治法对于VD的作用效果，本研究采用反复脑缺血再灌注的方法复制VD小鼠模型，观察补肾类中药、活血类中药、补肾活血类中药对模型小鼠行为学及脑组织脑源性神经营养因子(BDNF)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)含量的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物 清洁级雄性昆明小鼠，体重35～40 g，购自河北医科大学实验动物中心。动物合格证编号:906017。

1.2 实验用药 补肾方:由何首乌、益智仁、胡桃肉、人参组成。活血方:郁金、川芎、丹参、当归组成。补肾活血方:由何首乌、益智仁、胡桃肉、人参、郁金、川芎、丹参、当归组成。上药由本院煎药室煎制，补肾活血方浓缩成1.428 g/ml的混悬液，补肾方、活血方浓缩成0.714 g/ml的混悬液。尼莫地平片:石家庄市华龙药业股份有限公司生产，批准文号:国药准字H13021882。规格:20 mg/片，使用前用蒸馏水配制成浓度为1.558 mg/ml的药液。

1.3 主要仪器 小鼠电子水迷宫，中国医学科学院药物研究所。BDNF和bFGF定量酶联检测试剂盒:上海森雄科技实业有限公司。

1.4 分组及给药 从实验小鼠中随机抽取12只作为假手术组，其余随机分为模型组、补肾活血组、补肾组、活血组、阳性对照组，每组15只，实验结束后除去死亡，剩余只数见表1。各治疗组在造模后第2天给药治疗，补肾活血组灌服补肾活血方14.28 g/kg体重，补肾组，活血组均以7.14 g/kg体重灌服相应药物，阳性对照组灌服15.58 mg/kgod的尼莫地平药液，假手术组、模型组均灌服等剂量的生理盐水，均日1次，治疗14 d。

1.5 模型制备 参照文献〔2〕，除假手术组外，其余各组小鼠用10%水合氯醛腹腔注射麻醉，颈正中部常规消毒，切口，分离双侧颈总动脉，用4号丝线阻断血流20 min，同时在距尾尖1 cm处剪断尾端，放血约0.3 ml，热凝止血。松开丝线，恢复血流再灌注10 min后，再次阻断血流20 min，如此重复3次，第3次再灌注后用生理盐水清洗切口，缝合皮肤，局部注射庆大霉素0.2万U。假手术组只分离颈总动脉，穿线但不结扎，并且尾部不放血。

1.6 检测指标及方法

1.6.1 行为学检测 采用水迷宫测试。水迷宫为黑色有机玻璃板制成的水池，分为起始区、终点区和三个盲端。实验开始之前，设置水深为22 cm，水温为(24±1)℃，并引导小鼠从起点区游至终点区，共训练3次。训练结束后，记录小鼠5 min内从起点区游至终点区全程所需时间(5 min内未游到终点者，按5 min计)及进入盲端次数(错误次数)，作为学习成绩。24 h后再检测游完全程所需时间及进入盲端次数(错误次数)，作为记忆成绩。

1.6.2 各组小鼠脑组织BDNF和bFGF含量的变化 断头处死小鼠，冰盘上快速取脑，弃去嗅球及小脑，取脑组织称重，移至玻璃匀浆管中，并加入等倍体积的预冷生理盐水，于冰盘上匀浆，充分研碎，使组织匀浆化。制备好的 50%匀浆3 500 r/min离心10 min，提取上清。后采用双抗体夹心ABCELISA法检测脑组织BDNF和bFGF含量。

1.7 统计学处理 数据运用SPSS13.0统计软件处理，计量资料用±s表示，统计方法采用单因素方差分析，组间两两比较采用q检验。

2 结果

2.1 各组小鼠水迷宫学习记忆成绩的比较 与假手术组比较，模型组的游全程时间逐渐延长，错误次数增加，二者有统计学差异(P＜0.01)。与模型组比较，各治疗组学习成绩和记忆成绩均有显著提高，有统计学差异(P＜0.01)，补肾活血组的学习成绩与记忆成绩优于其他治疗组(P＜0.05或P＜0.01)。表明各组均有提高学习记忆能力的作用，而补肾活血组最优。见表1。

表1 各组小鼠水迷宫学习记忆成绩比较(±s)

表1 各组小鼠水迷宫学习记忆成绩比较(±s)

与模型组比较:1)P＜0.05，2)P＜0.01;与补肾活血组比较:3)P＜0.05;下表同

组别 n 学习成绩游全程时间(s) 错误次数(次)记忆成绩游全程时间(s) 错误次数(次)假手术组 12 37.08±19.252) 2.66±1.432) 51.83±21.312) 3.08±1.732)模型组 9 136.44±52.47 8.22±3.45 170.55±70.54 9.11±3.29补肾活血组 11 71.45±25.692) 3.72±2.452) 79.91±32.412) 4.18±1.722)补肾组 11 100.09±23.312)3) 5.91±1.811)3) 119.73±44.861)3) 6.36±3.071)3)活血组 11 98.90±28.452)3) 5.73±1.791)3) 123.64±48.451)3) 6.45±1.361)3)阳性对照组 10 101.00±24.361)3) 6.00±1.881)3) 121.20±47.011)3) 6.50±3.211)3)

2.2 各组小鼠脑组织BDNF和bFGF含量的比较 与假手术组比较，模型组小鼠脑组织BDNF和bFGF含量明显升高，二者有统计学差异(P＜0.05或P＜0.01)。与模型组比较，各治疗组小鼠脑组织BDNF和bFGF含量均明显升高，有统计学差异(P＜0.05或P＜0.01);补肾活血组的BDNF含量高于其他治疗组(P＜0.05或P＜0.01)，bFGF含量高于活血组和阳性对照组(P＜0.05)。见表2。

表2 各组小鼠脑组织BDNF和bFGF含量的比较(±s，ng/g·prot)

表2 各组小鼠脑组织BDNF和bFGF含量的比较(±s，ng/g·prot)

组别 n BDNF bFGF假手术组 12 504.85±83.342) 48.73±10.921)模型组 9 815.74±82.65 64.90±18.48补肾活血组 11 1 085.56±188.692) 103.10±21.752)补肾组 11 974.81±92.072)3) 95.49±11.672)活血组 11 919.30±61.391)3) 89.35±13.312)3)阳性对照组 10 930.48±98.831)3) 86.05±14.132)3)

3 讨论

神经营养因子(NTF)是由多种细胞分泌的一类对中枢和外周神经系统发挥营养作用的非常规营养物质，它可调节神经系统的代谢和功能活动，对神经系统损伤后的再生修复发挥着重要作用〔3〕。碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和脑源性神经营养因子(BDNF)为NTF家族重要成员，广泛分布于中枢神经系统内，具有保护神经元，促进神经生长，活化胶质细胞、修复血管内皮，促进新毛细血管形成等多种生物学活性〔4〕。

脑缺血发生后，BDNF不仅能够支持多种神经元的存活、发育、分化和损伤后修复，还可以通过调节组织突触可塑性，诱发和维持组织和皮质长时程增强效应而参与学习记忆过程，改善受损的学习记忆能力〔5〕。研究显示，与非认知障碍脑梗死患者相比，血管性认知障碍患者血清BDNF水平明显增高〔6〕，证明BDNF参与了脑梗死进展为认知障碍的病理生理过程。实验研究显示〔7，8〕，脑缺血后，VD大鼠脑组织的BDNF表达明显增多，直至15 d后脑组织BDNF阳性细胞逐渐减少，BDNF的升高对缺血后脑神经干细胞的诱导分化具有促进作用。bFGF是一种具有促进血管内皮细胞和胶质细胞存活，以及新毛细血管形成等多种生物学活性的多肽物质。脑缺血时，脑皮质和海马的bFGF表达会显著增强，促使脑组织bFGF含量增加，通过扩张血管和选择性地开放因缺血而关闭的微血管，提高脑血流量，改善局部缺血状态，并能促进神经生长，改善缺血造成的学习及记忆下降〔9〕。研究显示〔10〕，给予VD大鼠皮下注射外源性的bFGF，bFGF能迁移至海马，诱导海马产生巢蛋白(nestin)阳性细胞，刺激VD大鼠海马神经干细胞增殖，修复受损组织，改善VD大鼠的学习记忆能力。研究表明〔11〕，bFGF尚可通过调节脑神经递质5-HT和DA含量，从而改善VD小鼠学习记忆能力。

VD属于中医“健忘”、“呆病”范畴。中医认为本病病位在脑，涉及肝肾心脾，其病机为髓海空虚，脑脉瘀阻，故治当以填补肾精治其本，祛瘀通络治其标，补肾活血恰合病机。通过观察补肾方、活血方、补肾活血方对VD模型小鼠行为学及脑组织BDNF和bFGF含量的影响。结果显示，补肾活血组在促进小鼠学习记忆能力和提高BDNF含量方面均显著优于补肾组和活血组，在调节bFGF含量方面明显优于活血组。

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