白藜芦醇对大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用及其与sirt1-p53通路的关系

邬云斌 刘新伟 何东伟 刘 玲 (重庆医科大学附属第一医院麻醉科，重庆 400016)

白藜芦醇是一种在红酒和葡萄中存在的多酚类化学物质，具有强大的抗氧化、抗肿瘤、抗衰老、抗炎症等生物学特性，并且是迄今为止发现的最好的沉默信息调节因子蛋白1(silent information regulator protein 1，sirt1)激活剂。sirt1是一种NAD+依赖的蛋白去乙酰化酶，该酶的类似物首先在酵母中发现，对延缓细胞衰老具有重要作用。研究证实sirt1在心肌缺血再灌注(I/R)损伤中起着重要的保护作用〔1～3〕。陈丽函等〔1〕和 Yoshida等〔4〕先后报道了白藜芦醇能显著减轻大鼠心肌I/R损伤，其作用一定程度上和sirt1相关，但具体机制尚不清楚。近年来有研究报道sirt1抗细胞凋亡的机制可能与促凋亡蛋白p53去乙酰化有关〔5〕。但目前国内外尚无实验证实白藜芦醇是否通过sirt1-p53通路起到对I/R损伤心肌的保护作用。本实验采用在体大鼠心肌I/R动物模型，通过研究白藜芦醇在大鼠心肌I/R损伤中的作用，探讨其保护作用与sirt1-p53通路的关系。

1 材料与方法

1.1 动物分组及模型建立 健康雄性成年Wistar大鼠48只，体质量240～270 g(清洁级，合格证号:重医动质20101105)购自重庆医科大学实验动物中心。随机分为4组:单纯I/R组、白藜芦醇预处理组(Res+I/R组)，白藜芦醇预处理+ex527组(Res+ex527+I/R 组)，I/R+ex527组(I/R+ex527组)，每组12只。实验前置于实验室适应环境1 w。20%乌拉坦1 g/kg静脉麻醉大鼠，打开胸腔，暴露心脏剪开心包膜，于大鼠左冠状动脉前降支根部穿线结扎，观察心电图出现ST段立即抬高，心肌颜色由红色变为灰白色为成功标志，然后以盐水纱布覆盖，结扎45 min后剪开结扎线，恢复血流造成再灌注，再灌注时抬高的ST段回落50%以上，心肌颜色由灰白色变为红色，再灌注24 h后将大鼠处死。假手术组:仅开胸，于大鼠左冠状动脉前降支根部穿线但不结扎;I/R组:以生理盐水代替白藜芦醇舌下静脉给药，余与预处理组相同;Res+I/R组:白藜芦醇10 mg/kg分别于缺血前15 min及再灌注前1 min舌下静脉给药;Res+ex527+I/R组:白藜芦醇加药情况同前，分别于缺血前15 min及再灌注前1 min舌下静脉给药 ex527 1 μg/kg;ex527+I/R组:ex527加药情况同前。

1.2 试剂 白藜芦醇购自美国Alexis公司;TUNEL试剂盒购自Maxim BIO公司;兔抗大鼠第382位赖氨酸残基乙酰化p53(A-p53)购自博奥森公司;兔抗大鼠SIRT1购自protein tech公司;抗鼠/兔二抗及兔多抗GAPDH购自于碧云天公司。sirt1特异性抑制剂ex527购自caygen公司。

1.3 TUNEL法检测心肌细胞凋亡 操作按TUNEL检测试剂盒说明。实验结束后，立即取各组大鼠心尖部位的心肌常规固定、脱水、石蜡包埋、切片。从每组取5张石蜡切片，二甲苯脱蜡，梯度乙醇复水，然后PBS冲洗(共3次，每次5 min，下同);接着蛋白酶 K(20 μg/ml)消化30 min(37℃)，PBS冲洗;而后3%H2O2室温下处理5 min，加入含0.1%TritonX-100枸橼酸溶液，冰上4 min，PBS冲洗;再加入50 μl TUNEL 反应混合液(包括脱氧核苷酸转移酶液)，于37℃孵育60 min，PBS冲洗，然后加入POD液于37℃孵育30 min，PBS冲洗，DAB显色，光镜下观察。采用Image Pro Plus 4.5图像分析软件进行凋亡细胞计数。心肌细胞凋亡率即凋亡指数(AI)=凋亡心肌细胞核数/心肌细胞核总数×100%。

1.4 生化指标测定 动物处死后，采用分光光度法测定心肌组织中超氧化物歧化酶(SOD)、肌酸激酶(CK)、乳酸脱氢酶(LDH)含量，按照试剂盒说明操作。

1.5 心肌组织Bcl-2、Bax蛋白表达的免疫组化测定 每一标本取2个不同部位的切片各2张，采用链霉菌素抗生物素复合体(streptavidin-biotin complex，SABC)免疫组化检测 Bcl-2、Bax蛋白表达。主要流程如下:切片脱蜡入水→1%过氧化氢封闭POD 10 min→加山羊血清封闭→加Bcl-2、Bax蛋白的抗体，4℃过夜→滴加小鼠抗地高辛，再滴加生物素化抗小鼠IgG，37℃，30 min→加SABC，用DAB显色→苏木素复染→水洗，封片→镜检。阴性对照不加抗体，阳性对照用已知阳性片，阳性判断标准:以细胞质着棕黄色为阳性，用计算机图像处理系统，每次随机选10个视野，测定细胞阳性染色的OD值与阳性细胞百分比，计算蛋白阳性表达指数(positive expression index，PEI)，PEI=OD值×阳性细胞百分比×100，计算Bax和Bcl-2的比值。

1.6 Western印迹检测蛋白的表达 取各组大鼠心尖部位心肌组织，匀浆器研碎，加裂解液，离心后吸取上清液，Bradford法测定蛋白质浓度。各标本取50 μg，上样，SDS-PAGE电泳，蛋白转至PVDF膜，封闭液室温封闭后分别加入一抗和二抗，一抗为兔抗大鼠第382位赖氨酸残基乙酰化p53(1∶100)及兔抗大鼠sirt1(1∶1 000)，加入 ECL试剂，暗室曝光，显影、定影。电泳成像系统定量扫描分析，结果以GAPDH校正。

1.7 统计学处理 采用SPSS15.0统计软件，数据以±s表示，率的比较采用χ2检验，两组之间均数比较采用t检验。

2 结果

2.1 各组I/R心肌TUNEL染色结果 结果显示，用TUNEL法染色的阳性的心肌细胞具有形态变圆或不规则、与周围组织脱离、核固缩、染色质浓聚等典型的凋亡细胞形态特征，主要位于心肌梗死区与非梗死区交界处，而在心肌梗死区和非梗死区内仅见极少数散在凋亡细胞。与I/R组(18.31% ±2.76%)相比，Res+I/R组AI(9.08% ±2.56%)显著降低(P＜0.05)，Res+ex527+I/R组(17.08% ±2.67%)、ex527+I/R组(18.23% ±2.46%)无显著差别(P＞0.05);与 Res+I/R组相比，Res+ex527+I/R组、ex527+I/R组AI显著升高(P＜0.05)。见图1。

图1 各组大鼠心肌TUNEL染色结果(×200)

2.2 各组心肌组织中SOD、CK、LDH等生化指标变化 与I/R组相比，Res+I/R组CK、LDH显著减少，SOD显著增加。而加入sirt1特异性阻断剂ex527后，Res+ex527+I/R组较Res组CK、LDH显著增高，SOD显著降低(P＜0.05)。Res+ex527+I/R组与I/R组及ex527+I/R组相比，其差异不显著(P＞0.05)。见表1。

2.3 各组大鼠心肌组织中Bcl-2、Bax蛋白表达变化 Bcl-2和Bax蛋白表达的部位与凋亡细胞十分相似。与I/R组相比，Res+I/R组Bcl-2蛋白表达显著升高(P＜0.05)，Bax/Bcl-2低于I/R组(P＜0.05)，加入阻断剂ex527后，与Res+I/R组相比，Bcl-2蛋白表达显著降低(P＜0.05)，Bax/Bcl-2高于Res组。与Res+ex527+I/R组相比，I/R组及ex527+I/R组Bcl-2蛋白表达无显著差异(P＞0.05)，Bax/Bcl-2无显著差异(P＞0.05)。见表 2，图 2。

表1 各组大鼠心肌组织中SOD、CK、LDH水平比较(n=12±s)

表1 各组大鼠心肌组织中SOD、CK、LDH水平比较(n=12±s)

组别 SOD(U/ml) CK(IU/L) LDH(IU/L)I/R组72.9±6.9 92.1±10 7103.5±734.8 Res+I/R组 4.8±9.71) 72.1±8.41) 4 701.3±531.61)Res+ex527+I/R组 76.9±8.52) 92.1±8.92) 7 009.3±798.72)ex527+I/R组 83.7±9.12) 104.3±111.22)7 723.9±932.82)

与I/R组比较:1)P＜0.05;与Res+I/R组比较:2)P＜0.05;下表同

图2 各组大鼠心肌组织中Bcl-2、Bax蛋白表达(×200)

表2 各组大鼠心肌组织中Bcl-2、Bax蛋白表达变化(n=12±s)

表2 各组大鼠心肌组织中Bcl-2、Bax蛋白表达变化(n=12±s)

组别 Bcl-2 PEI(%) Bax PEI(%)Bax/Bcl-2 I/R组6.3±1.2 13.9±2.6 2.4±0.8 Res+I/R组 20.3±1.91) 14.1±2.51) 0.7±0.21)Res+ex527+I/R组 5.9±0.82) 14.2±3.02) 2.3±0.62)Ex527+I/R组 14.0±2.12) 14.9±3.12) 1.6±0.32)

2.4 各组大鼠I/R心肌组织中sirt1及乙酰化p53蛋白的表达 与I/R组相比，Res+I/R组sirt1蛋白表达均明显增高(P＜0.05)。Res+I/R组乙酰化p53蛋白表达明显低于I/R组(P＜0.05)，而与I/R组相比，ex527+Res+I/R组和ex527+I/R组乙酰化p53蛋白表达显著增加(P＜0.05)。见图3。

图3 各组大鼠sirt1和乙酰化p53蛋白表达

3 讨论

随着心肌梗死发生率增高和早期冠脉再通治疗的广泛开展，心肌I/R损伤是目前心肌保护中的重要课题。冠状动脉严重狭窄或阻塞后，早期血管再通和恢复血流是重要治疗措施，但是心肌I/R后可导致心律失常、梗死面积扩大及心功能不全等再灌注损伤。心肌细胞凋亡是I/R损伤的重要形式，研究表明〔6〕，多个促凋亡通路在该过程中激活。减少受损心肌细胞的凋亡一直是缓解I/R损伤的重点。本研究结果证实，白藜芦醇预处理显著降低心肌细胞凋亡率。然而，不同研究对白藜芦醇的作用机制观点不同。本研究发现，白藜芦醇的心肌保护作用与激活sirt1并启动sirt1-p53通路密切相关。

sirt1是重要的抗衰老蛋白，通过使多个蛋白去乙酰化而改变其活性，涉及细胞内基因沉默、能量代谢、抗细胞凋亡和氧化应激等多个生物功能。其中，sirt1能使促凋亡因子p53蛋白的第373、320和382位赖氨酸残基去乙酰化，从而抑制p53与靶DNA顺式原件结合，进而抑制p53促凋亡活性。Zhang等研究发现，sirt1增加使p53乙酰化程度降低，进而减少促凋亡蛋白Bax表达和细胞色素C出线粒体，降低阿柔比星诱导的心肌细胞凋亡〔7〕。研究发现，缺血预处理通过激活sirt1而降低心肌细胞内包括p53在内的蛋白乙酰化程度，进而减轻I/R损伤〔8〕。而白藜芦醇是目前为止发现的最好的sirt1激活剂，多个研究表明，其保护作用与激活sirt1密切相关。本实验结果表明，白藜芦醇预处理组sirt1表达量增加，同时乙酰化p53含量降低，p53启动转录的促凋亡蛋白Bax表达量也降低，而抗凋亡蛋白Bcl-2表达增加。另外，本实验在白藜芦醇预处理时加入sirt1特异性抑制剂ex527，结果发现ex527加入后乙酰化p53含量较白藜芦醇预处理组升高，同时心肌细胞凋亡率也升高。从反面证实白藜芦醇的保护作用是通过激活sirt1，进而降低p53的乙酰化程度而获得。

本实验结果提示，sirt1除了使p53乙酰化程度降低而减少细胞凋亡，也通过其他通路促进SOD产生而减轻细胞的氧化应激。这在其他研究实验中也得到证实〔9〕。综上，白藜芦醇激活sirt1，后者使促凋亡蛋白p53去乙酰化而失活，减少I/R中受损心肌细胞凋亡。并且激活的sirt1增加心肌组织内SOD含量，而减轻心肌细胞的氧化损伤。

1 陈丽函，王 伟，傅玉才，等.白藜芦醇对缺血再灌注心肌细胞凋亡及沉寂信息调节因子2表达的影响〔J〕.中国临床康复，2006;10(19):69-71.

2 Samuel SM，Thirunavukkarasu M，Penumathsa SV，et al.Akt/FOXO3a/SIRT1-mediated cardioprotection by n-tyrosol against ischemic stress in rat in vivo model of myocardial infarction:switching gears toward survival and longevity〔J〕.J Agric Food Chem，2008;56(20):9692-8.

3 Shinmura K，Tamaki K，Bolli R.Impact of 6-mo caloric restriction on myocardial ischemic tolerance:possible involvement of nitric oxide-dependent increase in nuclear Sirt1〔J〕.Am J Physiol Heart Circ Physiol，2008;295(6):H2348-55.

4 Yoshida Y，Shioi T，Izumi T.Resveratrol ameliorates experimental autoimmune myocarditis〔J〕.Circ J，2007;71(3):397-404.

5 Huang J，Gan Q，Han L，et al.SIRT1 overexpression antagonizes cellular senescence with activated ERK/S6k1 signaling in human diploid fibro-blasts〔J〕.PLOS ONE，2008;3(3):e1710.

6 Song JQ，Teng X，Cai Y，et al.Activation of Akt/GSK-3beta signaling pathway is involved in intermedin(1-53)protection against myocardial apoptosis induced by ischemia/reperfusion〔J〕.Apoptosis，2009;14(9):1061-9.

7 Zhang C，Feng Y，Qu S，et al.Resveratrol attenuates doxorubicin-induced cardiomyocyte apoptosis in mice through SIRT1-mediated deacetylation of p53〔J〕.Cardiovasc Res，2011;90(3):538-45.

8 Nadtochiy SM，Redman E，Rahman I，et al.Lysine deacetylation in ischemic preconditioning:the role of SIRT1〔J〕.Cardiovasc Res，2011;89(3):643-9.

9 Sundaresan NR，Pillai VB，Gupta MP.Emerging roles of SIRT1 deacetylase in regulating cardiomyocyte survival and hypertrophy〔J〕.J Mol Cell Cardiol，2011;51(4):614-8.