衰老血管内皮细胞增殖和凋亡与S1P2受体表达的关系

闾宏伟 陈淑华 黄利华 向 红 阳国平 邓 昊 黄志军 袁 洪

(中南大学湘雅三医院医学实验中心，湖南 长沙 410013)

衰老是心血管疾病的主要风险因子之一，内皮功能的改变在血管老化中发生最早。作为早期的病理生理改变，衰老所致的血管内皮功能障碍在心血管疾病的发生发展过程中起着重要作用。同时，内皮细胞衰老过程中，细胞的增殖、凋亡和其他功能也会发生相应的改变。探索衰老内皮细胞增殖、凋亡和其他功能的变化，以及可能的发生机制，有助于延缓血管衰老，降低老年人心脑血管性疾病发病率和死亡率〔1～3〕。笔者前期研究已经证实了体外培养的衰老内皮细胞的迁移和血管生成能力均有所下降，并与S1P2受体表达存在一定的相关性〔4～6〕。本研究旨在初步探讨衰老内皮细胞的增殖和凋亡改变，以及与细胞S1P2受体表达的相关性。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 标本来源与采集 标本均来自于中南大学湘雅三医院妇产科正常足月妊娠娩出的新生儿脐带。于无菌条件下剪下脐带放入装有M199培养基的无菌容器中，快速移入实验室，1 h内行脐静脉内皮细胞的分离培养。

1.1.2 试剂 M199培养基，胎牛血清(Hyclone);L-谷氨酰胺(Sigma公司);胰蛋白酶(Amresco公司);胶原酶Ⅰ、Ⅱ，青-链霉素(Gibco公司);S1P(biomol公司);BSA(Sigma公司);MTT(武汉博士德生物公司);Annexin V-FITC/PI试剂盒(BD公司);其他试剂均为国产分析纯。

1.2 方法

1.2.1 人脐静脉内皮细胞的分离和培养 将取来的脐带迅速移入洁净操作台内，无菌条件下将其放入提前盛有预热PBS的培养皿中，挤出脐带中的血，用剪刀修齐两断面，分成约20 cm的一段。找出脐静脉，用带平针头的注射器从一端插入脐静脉，血管钳固定，再用预热的PBS冲洗3次以上，将血迹完全冲洗干净。从冲洗的针头中注入0.1%胶原酶Ⅱ使其充盈，另一条以同样的方法注入0.1%胶原酶Ⅰ和0.25%胰酶等比混合消化液。取出针头，用止血钳夹住注入端，移入无菌烧杯中，置于37℃培养箱中孵育13 min。取出，松开注入端的血管钳，收集脐静脉内的消化液，然后注入含10%胎牛血清的M199培养液再次冲洗管腔，将消化液与冲洗液一并收集于离心管，1 000 r/min，离心5 min，弃上清，加入M199完全培养液〔含20%胎牛血清、5 U/ml肝素、50 μg/ml内皮细胞生长补充物 (ECGS)、100 U/ml青霉素和链霉素〕，轻轻吹打均匀，按4×105个细胞种植在直径10 cm的培养皿中，置于5%CO2、37℃培养箱中培养，每3天传代一次;计算细胞的累积细胞群体倍增值 (CPDL);当细胞的CPDL=60时，作为衰老细胞组 (S)，同时运用β-半乳糖苷酶染色来证实细胞的衰老;另分别于细胞的CPDL为15、35时，收集内皮细胞，作为年轻细胞组 (Y)和中年细胞组 (I)。

1.2.2 RT-PCR检测Y、I和S内皮细胞S1P2受体mRNA的表达 用TRIzolTM试剂提取每组细胞总RNA，逆转录成cDNA，以β-actin作为内对照，采用RT-PCR半定量检测内皮细胞的S1P2受体mRNA的表达。引物序列分别为:S1P2前向:CAAGTTCCACTCGGCAATGT， S1P2 反 向:CAGGAGGCTGAAGACAGAGG;β-actin前向:GAGACCTTCAACACCCCAG，β-actin反向:TCAGGTCCCGGCCAGCCA。方法如下:样品94℃预变性2 min，94℃变性20 s，60℃复性20 s，72℃延伸30 s，30个循环后，72℃延伸5 min。PCR产物用1.5%琼脂糖凝胶 (含溴乙啶0.5 mg/L)电泳检测。平行实验重复3次。

1.3 MTT法分析Y、I和S组内皮细胞的增殖 用含10%胎小牛血清的培养液配成单个细胞悬液，以每孔1 000～10 000个细胞接种到96孔板，每孔体积200 μl。培养至细胞达90%融合。每孔加 MTT溶液 (5 mg/ml用 PBS配制，pH7.4)20 μl，继续孵育4 h，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液，对于悬浮细胞需要离心后再吸弃孔内培养上清液。每孔加150 μlDMSO，振荡10 min，使结晶物充分融解。选择490 nm波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值，记录结果，以细胞分组为横坐标，吸光值为纵坐标绘制细胞生长曲线。

1.4 流式细胞术分析Y、I和S组内皮细胞的凋亡 收集培养的Y、I和S组内皮细胞，调整细胞浓度至1×106个/ml。每 100 μl的细胞悬液加 5 μl的 AnnexinV-FITC 和 1 μl PI工作液 (100 μl/ml)，根据Annexin V-FITC/PI试剂盒说明处理细胞，流式细胞仪检测各组内皮细胞的凋亡。

2 结果

2.1 RT-PCR检测Y、I和S组内皮细胞S1P2受体mRNA的表达 年轻内皮细胞S1P2受体mRNA的表达显著低于衰老内皮细胞 (P＜0.01)。见图1。

2.2 MTT法分析Y、I和S组内皮细胞的增殖 S组内皮细胞的增殖能力 (0.451±0.033)明显低于 Y和 I组细胞(0.887±0.016，0.683±0.021，P＜0.01)。

2.3 流式细胞术分析Y、I和S组内皮细胞的凋亡 S组内皮细胞的凋亡率显著高于Y和I组 (P＜0.01)。见图2。

图1 Y、I和S组内皮细胞的S1P2受体mRNA表达

图2 流式细胞术分析Y、I和S组内皮细胞的凋亡

3 讨论

细胞在体外培养一定代龄后，细胞增殖能力下降，最终生长停滞，细胞DNA合成能力下降，细胞周期阻滞于G1末期，不能进入S期，该过程称复制性衰老。细胞水平的复制性衰老作为研究整体衰老的体外模型，已被广泛认可。发生复制性衰老的不同类型细胞，有截然不同的凋亡敏感性，有的促进凋亡，有的抑制凋亡，细胞凋亡参与了整个衰老过程，并在其中各个环节发挥重要的作用。有些细胞衰老抑制细胞的凋亡，如Wang等〔7〕报道了去血清诱导鼠及人的成纤维细胞时，衰老细胞同年轻细胞相比，不易发生凋亡。Fung等〔8〕也报道衰老的嗅上皮细胞不容易发生凋亡。有些细胞衰老促进细胞凋亡，如Adams等〔9〕用视黄酸诱导关节软骨细胞的凋亡，发现随增龄软骨细胞容易发生凋亡。Hashimoto等〔10〕进一步发现，体外软骨细胞源性的凋亡小体具有碱性磷酸酶和NTP焦磷酸水解酶活性，能够使钙沉积，提示随增龄软骨细胞凋亡的增加可能与老年人易软骨钙化和患关节炎有关。对细胞衰老促进凋亡的机制，尚无系统阐述，一般认为衰老细胞线粒体DNA损伤、能量代谢障碍及自由基损伤导致其容易凋亡。

目前，衰老内皮细胞的增殖与细胞凋亡未见相关报道，本研究表明衰老内皮细胞的增殖能力明显下降和细胞凋亡明显增加，同时初步阐明了衰老内皮细胞的S1P2受体表达上调与内皮细胞增殖能力下降及细胞凋亡增加相关联。这为进一步研究S1P2受体介导内皮细胞衰老的机制及老年人心脑血管性疾病的预防和治疗提供了新的研究思路。

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8 Fung KM，Peringa J，Venkatachalam S，et al.Coordinate reduction in cell proliferation and cell death in mouse olfactory epithelium from birth to maturity〔J〕.Brain Res，1997;761(2):347-51.

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10 Hashimoto S，Ochs RL，Rosen F，et al.Chondrocyte-derived apoptotic bodies and calcification of articular cartilage〔J〕.Proc Natl Acad Sci U S A，1998;95(6):3094-9.