可溶性TGFβRⅡ对大鼠心肌梗死后心功能的影响*

张玲玲， 刘增长， 苏 立， 殷跃辉

(重庆医科大学附属第二医院心血管内科，重庆 400010)

心肌梗死(myocardial infarction，MI)是危害人类健康的常见心血管疾病之一，MI后常发生心肌纤维化，引起心室重塑，使得心脏收缩和(或)舒张功能受损，并最终导致慢性心力衰竭的发生发展。心肌纤维化不仅发生在梗死区，同时也发生在非梗死区，包含成纤维细胞的增殖和细胞外基质(extracellular martrix，ECM)的沉积，与整个心室腔的扩张、变形及心功能降低密切相关。作为强有力的致纤维化因子之一，转化生长因子β(transforming growth factor－β，TGF－β)在MI后大鼠心脏梗死区和非梗死区的表达明显上调，在心肌纤维化过程中发挥关键作用［1］。lsaka等［2］研究发现，可溶性转化生长因子βⅡ型受体(soluble transforming growth factor－β typeⅡreceptor，sTGFβRⅡ)能竞争性抑制内源性TGF－βRⅡ与TGF－β的结合或是作为负效应受体起作用，减轻实验性肾小球肾炎ECM的聚集，改善肾小球纤维化。然而，有关sTGFβRⅡ能否逆转心肌纤维化的研究国内外鲜有报道。因此，本研究旨在观察重组腺病毒载体pAd－sTGFβRⅡ对TGF－β介导的心肌纤维化的调节，探讨sTGFβRⅡ对大鼠MI后心功能的影响。

材料和方法

1 材料

1.1 动物 清洁级健康雄性SD大鼠50只，体重200－250 g，由重庆医科大学动物中心提供，动物使用许可证号为SYXK(渝)2007－0001。

1.2 主要试剂和仪器 重组腺病毒载体 pAdsTGFβ RⅡ由本课题组前期构建;Trizol试剂、逆转录(PrimeScriptTM)试剂盒(TaKaRa);Pfu PCR Master Mix试剂(北京天根生化科技有限公司);多聚赖氨酸溶液、兔抗鼠基质金属蛋白酶9(matrix metalloproteinase 9，MMP－9)多克隆抗体、SP免疫组化检测试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司);DAB显色试剂盒(北京中杉生物技术有限公司);明胶(Sigma)。TKR－200小动物呼吸机(江西特力麻醉呼吸设备有限公司);IX－70型偏振光学显微镜(Olympus);752型紫外分光光度仪(上海青华科技仪器公司);Thermo Hybaid Px2型PCR仪(Eppendorf);核酸电泳装置、Gel Doc 100型凝胶成像扫描分析仪(Bio－Rad)。

2 方法

2.1 MI大鼠模型的制备、分组及处理 40只SD大鼠称重后经3.5%水合氯醛溶液(10 mL/kg)腹腔注射麻醉，仰卧固定、备皮、消毒。用针形电极插入四肢皮下连接心电图机，观察记录肢体导联心电图。切开气管并插管，接上小动物呼吸机进行正压通气(潮气量20 mL，机械通气频率80次/min，呼吸比1∶1);在胸骨左缘扪及心脏搏动处纵行切开皮肤约3 cm，逐层钝性分离，于第3、4肋间开胸，暴露心脏，在肺动脉圆锥和左心耳之间于左心耳根部下方2 mm处进针，以6/0无损伤缝线穿过心肌表层，在肺动脉圆锥旁出针结扎左冠状动脉前降支，肉眼观察左心室前壁变苍白，同时在2个及以上肢体导联出现ST段弓背向上抬高0.2 mV以上，说明MI模型已成功建立;迅速将心脏复位，排尽气体，逐层关胸;待大鼠清醒时，拔除气管插管;术毕肌肉注射青霉素4×105U预防感染。术后3 d存活31只，随机分为 MI组(生理盐水 1 mL，n=10)、pAdsTGFβRⅡ组(pAdTrack－TO4－ sTGFβRⅡ病毒上清液，1.0×1010pfu 1 mL，n=11)、空载体组(pAdTrack，1.0 ×1010pfu 1 mL，n=10);另设假手术组(仅在左冠脉前降支相同部位穿线并不缝扎，生理盐水1 mL，n=10)。干预方式为术后第4 d下肢肌肉注射，方法同Okada等［3］研究，之后在相同条件下喂养，观察4周。

2.2 超声心动图检测 4周后麻醉大鼠，应用GE Vivid 7彩色多普勒超声诊断仪(探头频率13 MHz，深度3.5 cm，速度200 mm/s)在获得满意的胸骨旁左心室短轴二维图像后，测量心率(heart rate，HR)、左心室舒张末期直径(left ventricular end－diastolic dimension，LVEDD)、左心室收缩末期直径(left ventricular end－systolic dimension，LVESD)和射血分数(ejection fraction，EF)，取连续3个心动周期的平均值。

2.3 标本留取 超声心动图检测后，大鼠称重并处死，开胸取心脏，冰生理盐水洗净，滤纸吸干，沿房室沟剔除心房、血管组织，紧贴室间隔右下侧剔除右心室游离壁，余下左心室，沿梗死区中部垂直于长轴的方向切取厚约3－5 mm的心肌组织块放入4%多聚甲醛缓冲液中固定24 h，常规脱水，透明，石蜡包埋，切片备用，切片厚度约5 μm。余下部分经液氮速冻后转－80℃冰箱保存，用于冰冻切片、RT－PCR和明胶酶谱法检测。所有标本制作条件完全相同以避免人工误差。

2.4 冰冻切片检测sTGFβRⅡ基因的表达 取液氮冻存的心肌组织做冰冻切片，在荧光显微镜下观察绿色荧光细胞的数量和密度，检测sTGFβRⅡ基因在心肌组织中的表达情况。

2.5 天狼星红－饱和苦味酸染色观察心肌Ⅰ、Ⅲ型胶原的表达 石蜡切片常规脱蜡入水，双蒸水洗;切片入Harris苏木素染液5 min;自来水洗10 min;盐酸乙醇分色10s，水洗;入天狼星红－饱和苦味酸染液30 min;自来水速洗，蒸馏水洗，滤纸吸干;无水乙醇分化与脱水;二甲苯透明;适量中性树胶封片。偏振光学显微镜下观察心肌Ⅰ、Ⅲ型胶原的染色情况。

2.6 RT－PCR法检测左心室非梗死区 MMP－9 mRNA的表达 (1)RNA提取:按照Trizol试剂说明书提取总RNA，并溶于20 μL DEPC处理水中。(2)RNA纯度及浓度测定:用1 mL蒸馏水将紫外分光光度计校正调零。将1 μL RNA样品与1 mL蒸馏水混匀，转入石英杯中，分别读取A260和A280值，计算RNA样品中的A260/A280，以该比值≥2.0为纯度合格，其样品进入后续实验;按下列公式计算RNA样品浓度:RNA样品浓度(g/L)=A260值×40×稀释倍数×10－3，用无RNA酶纯水将RNA样品浓度调至1 g/L。(3)RT反应:应用TaKaRa逆转录试剂盒按照说明书进行 cDNA第 1链合成。(4)PCR反应:根据PubMed上GenBank提供的基因序列，以β－actin基因为内参照，扩增MMP－9基因(NM 031055.1)的引物序列，上游引物 5＇－CCCTGCGTATTTCCATTCATC －3＇，下游引物 5＇－ GGCTTGGGTCAGGTTTAGAG－3＇，PCR产物的大小为500 bp;扩增β－actin(NM 031144.2)的引物序列，上游引物5＇－CACCCGCGAGTACAACCTTC －3＇，下游引物 5＇－ CCCATACCCACCATCACACC－3＇，PCR 产物的大小为 250 bp。上述引物由上海生物工程有限公司合成。PCR条件为:94℃预变性3 min;94℃ 30 s，57℃ 30 s，72℃45 s，共35个循环;再72℃ 5 min。(5)PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳，用凝胶成像扫描分析仪摄像，结果用Quantity One 4.6.2软件分析后计算MMP－9与β－actin吸光度比值代表其相对表达量。

2.7 免疫组织化学方法检测心肌MMP－9蛋白的表达 采用链霉菌抗生物素蛋白－过氧化物酶(streptavidin peroxidase，SP)法进行免疫组化检测。石蜡切片常规脱蜡水化，微波加热修复抗原20 min，冷却至室温;3%H2O2去离子水室温孵育30 min灭活内源性过氧化物酶，PBS洗涤5 min×3次;每张切片滴加50 μL正常山羊血清封闭液，室温孵育30 min，甩去余液;每张切片滴加50 μL PBS缓冲液稀释的的兔抗鼠MMP－9多克隆Ⅰ抗(1∶50);4℃冰箱过液，37℃复温45 min，PBS洗涤5 min×3次;滴加生物变化Ⅱ抗，37℃孵育30 min，PBS洗涤5 min×3次;滴加链霉素抗生物素－过氧化物酶溶液，37℃ 孵育20 min;DAB显色;苏木精轻度复染;分色、脱水、透明和封片。同时用PBS代替MMP－9Ⅰ抗作阴性对照。免疫组化染色结果用Image－Pro Plus 4.5图像分析软件测量蛋白表达的累积吸光度值(integrated absorbance，IA)和平均吸光度值，其值越大分别代表蛋白表达量越多、强度越高。

2.8 明胶酶谱法检测心肌MMP－9的活性 取液氮冻存的心肌组织0.3 g加入1 mL蛋白提取液匀浆，12000 r/min、4℃离心20 min，取上清分装，用Bradford法蛋白定量;与上样缓冲液以1∶2混合后上样于含1%明胶的8%SDS－聚丙烯酰胺凝胶，加marker后电泳(60 V，30 min;100 V 120 min);电泳结束后将凝胶置于2.5%Triton X－100溶液中室温摇洗2次，每次30 min;然后以漂洗液(50 mmol/L Tris－HCl，5 mmol/L CaCl2，pH 7.6)漂洗2 次，每次20 min，再置于新鲜孵育液(50 mmol/L Tris－HCl，pH 7.5， 10 mmol/L CaCl2， 150 mmol/L NaCl，0.02%NaN3)中37℃孵育24 h;弃去孵育缓冲液，加入0.25%考马斯亮蓝染液染色3 h，用脱色液脱色至背景清晰为止;用Gel Doc 100型凝胶成像扫描分析仪在灰阶模式下扫描，结果用Quantity One 4.6.2软件分析以条带的吸光度值相对定量心肌MMP－9的活性。

3 统计学处理

结 果

1 各组大鼠心脏超声心动图检测结果

MI后4周，与假手术组比较，MI组、空载体组HR、LVEDD和 LVESD均明显升高(P＜0.01)，EF值明显降低(P＜0.01);pAd－sTGFβRⅡ组仅LVEDD升高(P ＜0.05)，HR、LVESD、EF值无显著差异。与MI组比较，pAd－sTGFβRⅡ组HR、LVEDD和LVESD均明显减小(P＜0.01)，EF值明显增高(P＜0.01);空载体组各项指标与MI组比较无显著差异，见表1。

表1 MI后4周各组大鼠超声心动图各项指标的检测结果Table 1.The evaluation of HR，LVEDD，LVESD and EF of the rats in various groups by echocardiograms(.n=10)

表1 MI后4周各组大鼠超声心动图各项指标的检测结果Table 1.The evaluation of HR，LVEDD，LVESD and EF of the rats in various groups by echocardiograms(.n=10)

*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs sham group;##P ＜0.01 vs MI group.

Group HR(min－1) LVEDD(mm) LVESD(mm) EF(%)Sham 458.00 ±4.06 4.80 ±0.41 2.89 ±0.31 68.08 ±2.89 MI 473.00 ±10.36＊＊ 7.10 ±0.31＊＊ 4.86 ±0.43＊＊ 37.27 ±3.62＊＊pAd － sTGFβRⅡ 460.77 ±5.76## 5.25 ±0.33*## 3.21 ±0.34## 57.38 ±4.13##Vector 469.58 ±7.12＊＊ 7.01 ±0.35＊＊ 4.98 ±0.27＊＊ 35.54 ±3.52＊＊

2 冰冻切片检测sTGFβRⅡ基因的表达结果

重组腺病毒载体pAd－sTGFβRⅡ含有绿色荧光蛋白基因，假手术组大鼠心肌组织中无绿色荧光蛋白，pAd－sTGFβRⅡ组可见大量的绿色荧光蛋白表达，表明sTGFβRⅡ基因在心肌组织中得到高效表达，见图1。

3 天狼星红－饱和苦味酸染色结果

偏振光学显微镜下观察:Ⅰ型胶原纤维呈红色或黄色，排列紧密，具强双折光性;Ⅲ型胶原纤维呈绿色，细纤维，弱双折光性。与假手术组比较，MI组和空载体组左心室非梗死区Ⅰ型和Ⅲ型胶原均显著增加，其中以Ⅰ型胶原增加更为显著，提示MI晚期胶原网络重塑以Ⅰ型胶原增生为主。MI组与空载体组之间无明显差异。与MI组比较，pAd－sTGFβRⅡ组非梗死区Ⅰ型和Ⅲ型胶原均明显减少，但与假手术组相比其表达仍稍有增加，见图2。

Figure 1.Expression of sTGFβRⅡ gene in myocardial tissues of rats in sham group(A)and pAd－sTGFβRⅡ group(B)(frozen section，×400).图1 心肌组织sTGFβRⅡ基因的表达结果

Figure 2.Content and distribution of collagen typeⅠ andⅢ in the left ventricular non－infarcted zone of rats in sham group(A)，MI group(B)，pAd－sTGFβRⅡ group(C)and vector group(D)(picrosirius red staining，×400).图2 各组大鼠左心室非梗死区Ⅰ、Ⅲ型胶原的表达

4 MMP－9 mRNA表达的琼脂糖凝胶电泳分析

MI后4周，MMP－9 mRNA相对表达量在假手术组、MI组、pAd－sTGFβRⅡ组和空载体组分别为0.392±0.008、0.526 ±0.021、0.436±0.012 和0.499±0.017。与假手术组比较，其余3组左心室非梗死区MMP－9 mRNA的表达量明显增加(均P＜0.01);与 MI组比较，pAd－sTGFβRⅡ组 MMP－9 mRNA的表达量明显减少(P＜0.01)，见图3。

Figure 3.Expression of MMP－9 mRNA in the left ventricular non－infarcted zone of rats in various groups.A:agarose gel electrophoresis.Lane 1:sham group;Lane 2:MI group;Lane 3:pAd －sTGFβRⅡ group;Lane 4:vector group.B:the relative expression normalized with β－actin..n=10.＊＊P＜0.01 vs sham group;##P＜0.01 vs MI group.图3 MI 4周后各组大鼠左心室非梗死区MMP－9 mRNA表达量

Figure 4.Expression of MMP－9 protein in myocardial tissues of rats in sham group(A)，MI group(B)，pAd－sTGFβRⅡ group(C)and vector group(D)(immunohistochemical staining，×400).图4 各组大鼠心肌组织MMP－9蛋白表达情况

5 MMP－9蛋白免疫组化染色结果

图4显示，MMP－9阳性染色定位于心肌细胞浆和成纤维细胞浆，呈棕黄色。与假手术组比较，MI组、pAd－sTGFβRⅡ组和空载体组左心室非梗死区MMP－9蛋白表达量增加(均 P＜0.01);与MI组比较，pAd－sTGFβRⅡ组 MMP－9蛋白表达水平明显降低(P＜0.01)，空载体组无明显差异，见图4、表2。

表2 MI 4周后各组大鼠心肌组织MMP－9蛋白表达量的比较Table 2.MMP－9 protein content in myocardial tissues of rats in various groups(.n=10)

表2 MI 4周后各组大鼠心肌组织MMP－9蛋白表达量的比较Table 2.MMP－9 protein content in myocardial tissues of rats in various groups(.n=10)

IA:integrated absorbance.＊＊P ＜0.01 vs sham group;##P ＜0.01 vs MI group.

Group IA AverageA Sham 61538.6 ±3269.5 0.0076 ±0.0003 MI 332829.2 ±16883.7＊＊ 0.0462 ±0.0023＊＊pAd － sTGFβRⅡ 172623.1 ±15087.4＊＊## 0.0222 ±0.0021＊＊##Vector 312730.3 ±16338.3＊＊ 0.0445 ±0.0025＊＊

Figure 5.The activity of MMP －9 in myocardial tissues of rats in various groups.A:gelatin zymography to detect MMP －9 activity.Lane 1:sham group;Lane 2:MI group;Lane 3:pAd－sTGFβRⅡ group;Lane 4:vector group.B:the protein activity was quantified..n=5.＊＊P＜0.01 vs sham group;##P＜0.01 vs MI group.图5 MI 4周后各组大鼠心肌组织MMP－9的活性

6 心肌MMP－9活性测定结果

图5显示，84 kD处有1条酶条带，为MMP－9的活性形式。MMP－9蛋白表达活性在假手术组、MI组、pAd－sTGFβRⅡ组和空载体组分别为0.35±0.03、1.78±0.08、1.32±0.11和1.83±0.07。与假手术组比较，其余3组左心室心肌MMP－9的活性显著升高(均 P＜0.01);与 MI组比较，pAdsTGFβRⅡ组MMP－9的活性显著降低(P＜0.01)。

讨 论

心肌纤维化被公认为是MI后心力衰竭发生发展的重要环节。如何减缓或逆转MI后心肌纤维化成为近年来临床和基础研究的热点。近年来研究发现，TGF－β可刺激成纤维细胞增殖，诱导成纤维细胞向肌成纤维细胞分化及ECM大量合成，促进心肌纤维化的发生和发展［4，5］。因此，抑制 TGF－ β 介导的生物学效应有可能成为未来预防MI后心力衰竭发生的有效策略。本研究采用携带sTGFβRⅡ基因的重组腺病毒载体pAd－sTGFβRⅡ转染MI大鼠，使其在心肌组织中得到高效表达，与内源性TGFβRⅡ竞争性结合TGF－β，由于不包含胞内激酶区而不能磷酸化，TGF－β信号下传受到抑制，心肌纤维化减轻，心功能得到改善，与Lian等［8］的研究结果相似。

MI后心肌间质胶原重塑是指胶原的形态、结构、生化(包括胶原含量、Ⅰ/Ⅲ型胶原比例、特性、构型、排列等)发生异常改变。有研究发现MI后心肌间质Ⅰ型和Ⅲ型胶原的合成显著增加及Ⅰ/Ⅲ型胶原比例失调，使得心肌僵硬度增加、心脏顺应性降低及心室腔扩大，最终导致心脏舒缩功能不全［9］。本研究观察了MI 4周的大鼠左心室非梗死区胶原重塑方面的改变，发现MI组与空载体组Ⅰ、Ⅲ型胶原含量和Ⅰ/Ⅲ型胶原比例较假手术组均明显增加，表明MI后心肌成纤维细胞合成和分泌胶原蛋白增加，胶原类型比例改变及心肌胶原网络重塑以Ⅰ型胶原增生为主;而pAd－sTGFβRⅡ组低于MI组，表明抑制TGF－β信号能减少左心室非梗死区Ⅰ、Ⅲ型胶原含量，同时还能改善胶原类型比例，逆转胶原重塑，与Ellmers等［10］研究结果一致。另外，本研究发现MI组与空载体组HR、LVEDD和LVESD较假手术组均明显升高，EF值显著降低，提示MI后心功能明显下降可能与胶原沉积尤其是Ⅰ型胶原增加显著使心室壁顺应性下降有关;而pAd－sTGFβRⅡ组上述改变明显减轻，表明sTGFβRⅡ干预使MI后左心室功能得到改善。

基质金属蛋白酶是降解ECM的最主要酶系，其表达量和活性升高将使胶原蛋白纤维化反应性增加，相反MMP的表达量和活性降低将改善心肌纤维化［11］。MMP－9可降解明胶和正常的胶原蛋白，使心肌间质被缺乏连接结构的纤维化间质所取代，导致心室扩大，心功能降低。亦有研究发现MMP－9基因缺陷小鼠MI后LVEDD和LVESD均比野生型小鼠显著减小，胶原沉积亦减少，左心室扩张得到改善，且心脏破裂的发生率明显降低，足见MMP－9在MI后基质代谢和心肌纤维化中的作用［12］。本研究发现MI后左心室非梗死区MMP－9 mRNA、蛋白表达水平及其活性均明显增高，但pAd－sTGFβRⅡ组较MI组、空载体组明显降低，并同时伴随Ⅰ、Ⅲ型胶原含量的减少和胶原类型的改善，表明sTGFβRⅡ抑制TGF－β介导的MMP－9表达可能是改善MI后心肌间质胶原重塑并最终减轻心肌纤维化的机制之一。由于调控MMP－9活性和表达的因素有很多，我们仍需更多的研究去探讨MMP－9是否可作为MI后心肌纤维化的治疗靶标。

总之，本研究表明sTGFβRⅡ干预能够改善MI后左心室功能，其作用机制可能与其下调MMP－9的表达、改善心肌间质胶原重塑、减轻心肌纤维化有关。

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