二氯喹啉酸诱导烟草保护酶活性的动态变化

陈泽鹏，邓建朝，陈伟明，万树青*

（1.广东省烟草公司，广州 510600；2.华南农业大学农药与化学生物学教育部重点实验室，广州 510642）

二氯喹啉酸（Quinclorac）是由德国巴斯夫公司开发的新型喹啉酸类激素型除草剂，主要用于水稻插秧前后的稗草和其他杂草的防除，是我国稻田使用的主要除草剂[1-3]。由于二氯喹啉酸在土壤中的残留时间较长，不易降解，因而对许多后茬敏感作物的生长造成一定的影响。

1999—2002年，广东省部分烟区出现烟草畸形生长现象，结果造成烤烟品质下降，受害严重的烟田无烟叶可收。后经分析，致畸原因为土壤中残留二氯喹啉酸[4-6]。作者经多次深入田间观察发现，凡畸形生长的烟草田块，很难找到受其他病害侵袭的烟株。为了弄清原因，在开展致畸机理研究的同时，对畸形烟叶的耐病性因子也展开了一些探索。在二氯喹啉酸化学胁迫下，检测烟草体内保护酶特别是SOD和POD活性的变化，试验设计了二氯喹啉酸不同浓度、不同时间处理后烟草体内 SOD活性和POD活性动态变化，以了解烟草畸形生长与保护酶活性变化的关系，对深入了解二氯喹啉酸对烟草毒害效应的机理以及诱导抗病性具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试烟草（Nicotiana tabacumL.）品种为 K326。温室播种，育苗，于3～4片真叶期移栽。

供试药剂为50%二氯喹啉酸可湿性粉剂，由江苏新沂中凯农用化工有限公司生产。采用盆栽法，在土中分别混入 0（CK）、1.04×10-3、2.08×10-3、4.17×10-3、8.33×10-3和 1.67×10-2mg/kg 二氯喹啉酸。

1.2 试验方法

1.2.1 超氧化物歧化酶（SOD）活性的测定 参照植物生理学实验指导方法[7]，稍作改动。酶液制备：取第4片展开烟草叶片，去中脉，准确称取0.30 g（共3份）于预冷的研钵中，加入预冷的提取介质1.5 mL（分3次加入，1次研磨，2次冲洗），在冰浴中研磨成匀浆，转移至1.5 mL离心管中，-4 ℃13 000 rpm下冷冻离心20 min，上清液即为SOD粗提液。

显色反应：取透明度好、质地相同的试管，样品测定管和对照管（一支遮光，2支照光），按表1加入试剂。

表1 显色反应试剂配置Table 1 The formula of color reaction reagent

混匀后，给1支对照管罩上比试管稍长的双层黑色硬纸套遮光，与其他各管同时置于4 000 lx紫外灯下反应 5 min（要求各管照光情况一致，反应温度控制在 25～35 ℃之间，视酶活性高低适当调整反应时间）。

样品超氧化物歧化酶活性的测定：

至反应结束后，用黑布罩盖上试管，终止反应。以遮光的对照管作为空白，分别在560 nm波长下测定各管的吸光度，按下式计算SOD活性。

式中：SOD总活性以每克鲜重酶单位表示。A0—照光对照管的光吸收值，As—样品管的光吸收值，V1—样液总体积（mL），VT—测定时样品用量（mL），W—样品鲜重（g）。

1.2.2 超氧化物歧化同工酶的测定 参照参考文献[7]的方法。采用聚丙烯酰胺垂直板电泳技术。分离胶浓度为10%，浓缩胶为3%。电极缓冲系统pH 7.8磷酸缓冲液，酶的进样量30 µL，电泳是在4 ℃的冰箱中进行，电泳时间为 4h。0显色后照相，测量各酶带的Rf值。

1.2.3 过氧化物酶（POD）活性测定 参照参考文献[8]的方法。准确称取所测叶片0.3 g于预冷的研钵中，加入预冷的Tris2HCl缓冲液（pH 8.5）1.5 mL，冰浴中研磨成匀浆，转移至1.5 mL 离心管中，-4℃，13 000 r/min 下离心20 min，取上清液分析。反应体系中加入2.8 mL含18 mmol/L愈创木酚的磷酸缓冲液和0.1 mL的酶提液（对照用0.1 mL的磷酸缓冲液代替）；最后再加入0.1 mL的1%双氧水溶液。按酶活性连续记录法用1 cm比色皿测定反应体系在470 nm处的吸光度OD470；每个样品重复3次，酶活性以单位鲜重叶片在单位时间内光密度的变化值表示(OD/g•min)。根据处理和对照所测的酶活力的变化，计算酶活力影响率，即：酶活力抑制或激活率/%=[(对照酶活力-处理酶活力)/对照酶活力]×100。若所得值为负值，表明为激活效应。

1.2.4 过氧化物同工酶测定 参考邹琦的方法[7]，采用聚丙烯酰胺凝胶垂直平板电泳技术。浓缩胶浓度为3%，分离胶浓度7.5%，电极缓冲系统pH 8.3（Tris甘氨酸缓冲液），上样量每孔30 µL，稳压电泳，在开始电泳时，调节电压80 V，0.5 h后变为100 V。整个电泳过程在冰箱中进行，历时3～4 h。显色后照相，测量各酶带的Rf值。

1.3 数据统计与分析

本研究的数据采用Microsoft Excel 2000软件处理，并用SAS国际通用统计软件包分析数据，对试验结果用邓肯氏新复极差多重比较法（Duncan,s Muitiple Range Test，DMRT）进行差异显著性分析。

2 结 果

2.1 二氯喹啉酸对烟草超氧化物歧化酶活性的影响

从图1可以看出，移栽后14 d，二氯喹啉酸浓度为 1.04×10-3、2.08×10-3、4.17×10-3、8.33×10-3、1.67×10-2mg/kg处理烟草SOD活性较对照有升高趋势，分别较对照提高9.21%、32.60%、109.36%、136.16%、151.94%。移栽后 21 d，处理与对照差异不显著。

图1 二氯喹啉酸对烟草叶片SOD活性的动态变化Fig.1 Dynamic reaction of SOD in tobacco treated with quinclorac

2.2 二氯喹啉酸对烟草超氧化物歧化同工酶的影响

从图2看出，烟草的超氧化物酶带有4条，相对迁移率 Rf分别为 0.49（Rf1）、0.55（Rf2）、0.58（Rf3）、0.63（Rf4）。不同浓度二氯喹啉酸处理烟草30 d的超氧化物酶活性较对照差异不显著。

图2 二氯喹啉酸处理烟叶30 d的超氧化物歧化酶凝胶电泳图Fig.2 The electrophoretogram of SOD in tobacco treated with quinclorac after 30d

2.3 二氯喹啉酸对烟草过氧化物酶活性的影响

从图3看出，当移栽后28 d，不同浓度处理的烟草叶片酶活力达到一个峰值，对照和二氯喹啉酸浓度分别为 1.04×10-3、2.08×10-3、4.17×10-3、8.33×10-3和1.67×10-2mg/kg处理的烟草，其过氧化物酶活力分别为17.47、29.61、23.73、30.33、41.00、57.73 OD/（g·min-1），各处理的烟草叶片中过氧化物酶活性比对照分别提高69.47%、35.80%、73.61%、134.69%、230.45%。35 d所测结果表明，除1.67×10-2mg/kg浓度的烟草酶活力略有降低外，其他均呈上升趋势（图3），表明烟草经二氯喹啉酸处理后，过氧化物酶的活力有所提高。

图3 二氯喹啉酸对烟草叶片POD活性的动态变化Fig.3 Dynamic reaction of POD in tobacco treated with quinclorac

2.4 二氯喹啉酸对烟草过氧化物同工酶的影响

从图4看出，二氯喹啉酸不同处理与对照相比，烟根酶带形态存在一定的差异。凡处理的烟草根共显现9条酶带，相对迁移率Rf分别为0.09（Rf1）、0.13（Rf2）、0.19（Rf3）、0.24（Rf4）、0.31（Rf5）、0.35（Rf6）、0.37（Rf7）、0.63（Rf8）、0.66（Rf9）。二氯喹啉酸处理的烟根与对照相比还新增一条酶带 Rf1，且二氯喹啉酸处理后的酶带颜色较对照明显加深。随着二氯喹啉酸施用量的增加，酶带变宽，显色加重，说明酶活性有所上升。二氯喹啉酸处理的烟叶诱导过氧化物同工酶活性与根所表现的活性趋于一致，不同的是诱导同工酶酶带为10条[9]。

图4 二氯喹啉酸处理烟草根的过氧化物酶凝胶电泳图Fig.4 The electrophoretogram of POD in tobacco root treated with quinclorac

3 讨 论

水稻与烟草轮作烟区，由于水田施用二氯喹啉酸防除稗草，残留土壤中的二氯喹啉酸可引起后茬烟草出现畸形生长[4]。从畸形的形态分析，烟草叶面向内褶，叶色加深，严重时叶面仅存叶脉而无叶肉组织。盆栽试验也表明，在不同浓度和时间下，二氯喹啉酸对烟草叶长和叶宽具有显著的抑制效应，这些症状表明，二氯喹啉酸对烟草致畸作用是与抑制细胞分裂有关。但这种畸形植株不会枯萎死亡，而同样条件下的靶标植物稗草可出现枯萎死亡现象。两种植物对二氯喹啉酸表现出不同的中毒反应，表明烟草对二氯喹啉酸有一种解毒机制。通过检测二氯喹啉酸对烟草两种保护酶的反应表明，在二氯喹啉酸长时间的胁迫条件下，能诱导激活烟草保护酶的活性，测得不同浓度下，二氯喹啉酸随着浓度升高，POD活性提高，在1.67×10-2mg/kg下，移栽28 d后可提高230%。SOD的活性在移栽后14 d达到峰值。由于保护酶具有清除自由基毒害的功能，在一定范围内减轻由此产生的氧自由基给机体造成的损伤，使之维持烟草生活的状态，POD和SOD在一定程度上活性都有升高，从而在清除烟草体内自由基中起到重要的作用。

试验中二氯喹啉酸的化学胁迫使得烟草内保护酶系（SOD和 POD）活性提高，而且畸形烟草几乎未发现感染真菌和细菌病害。由此可以得出推论，二氯喹啉酸的化学胁迫可以诱导畸形烟草内SOD和POD酶活性提高，同时增强了烟草抗病的能力。当然保护酶系还包括苯并氨酸解氨酶（PAL）,多酚氧化酶（PPO）等，要具体明确二氯喹啉酸与诱导抗病效应之间的关系，还需要进一步对二氯喹啉酸对PAL和PPO酶活性的影响进行研究。该研究对于寻找诱导烟草抗病物质，提高植物潜在的抗病能力给了我们新的启示。

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