葛根素对肾性高血压大鼠apelin－12、AngⅡ及NO含量与血压的影响*

黄帧桧，张 培，杨 帆，丁伯平

(皖南医学院药理学教研室，中药药理国家三级实验室，安徽 芜湖 241002)

高血压是最常见的心血管疾病，会引起严重的心、脑、肾并发症，威胁人类健康。因此，对于高血压及其并发症治疗的研究有着重大意义。在肾性高血压的发生机制中，最重要的是肾素-血管紧张素系统(renin-angiotensin system，RAS)被异常激活。RAS可调节水钠平衡、血管收缩张力，对肾性高血压的发生发展起到重要作用。而在RAS中关键因子无疑是血管紧张素Ⅱ(angiotensin II，AngⅡ)。

1998年日本科学家发现了一种新的调节肽apelin。Apelin的前体由77个氨基酸组成，在体内可生成长度不等的多肽片段，常见的有apelin-12、apelin-13、apelin-36。Apelin具有降低血压、调节心脏和舒张血管的功能［1-3］。Apelin与其受体APJ组成系统，该系统与血管紧张素Ⅱ-血管紧张素Ⅱ1型受体(AngⅡ-AT1)系统失衡可能是高血压发生发展的重要因素［4］。

葛根素来源于豆科植物葛的根，临床上用于治疗冠心病、高血压等疾病［5］。本实验室曾观察葛根素对肾性高血压大鼠肾脏AngⅡ含量的影响［6］，初步探讨过葛根素的降压机制。但有研究发现，apelin-36在肾性高血压的发生过程中起着重要作用［7-8］。另有研究发现，apelin-12 比 apelin-36的降压作用更明显［9］。本研究以葛根素为肾性高血压大鼠的治疗药物，观察其对高血压发病的一系列相关因素——apelin-12、Ang II和一氧化氮(nitric oxide，NO)水平的影响，初步探讨其可能的降压机制。

材料和方法

1 动物

SD大鼠65只，雄性，体重180～220 g。购自南京青龙山实验动物中心，许可证号SCXK(浙)2008-0033。分笼饲养，每笼1只，保持温度22℃ ～24℃，湿度60% ～65%，自由进食饮水。

2 药物

葛根素注射液，山东方明药业股份有限公司，批号为H20033292;卡托普利，上海普康药业有限公司，批号为H31021327。

3 试剂

AngⅡ放射免疫试剂盒，北京北方生物技术研究所，批号为20100820;NO试剂盒，南京建成生物工程研究所，批号为20100919;大鼠apelin-12 ELISA检测试剂盒，北京博奥森生物技术有限公司，批号为20110301B。

4 仪器

ALC-NIBP无创尾动脉血压心率测定系统(上海奥尔科特生物科技有限公司);匀浆仪(PRO250);高速低温离心机22R(Beckman Coulter);HH.S型电热恒温水浴锅(江苏省医疗器械厂);GC21500型γ放射免疫计数器(安徽中科中佳科学仪器有限公司);U-2800分光光度计(日立公司);ELx800酶标仪(BioTek)。

5 主要方法

雄性SD大鼠65只，普通饲料适应性喂养1周，随机抽取8只作为假手术组，其余57只采用两肾一夹法造成肾性高血压大鼠模型。以25%乌拉坦(4 mL/kg)腹腔注射麻醉大鼠，分离左肾动脉、放置内径为0.2 mm的银夹并打结固定。假手术组操作方法同上，但不放置银夹。术后3 d连续给予青霉素4×105U肌注预防感染。尾袖法测定清醒大鼠术前、术后及用药后动脉压，术后4周收缩压≥160 mmHg者为造模成功［10］，入选肾性高血压大鼠(renal hypertensive rat，RHR)组。将手术成功的42只大鼠随机分成5 组:高(n=9)、中(n=8)、低(n=8)剂量葛根素组分别以及卡托普利组(n=9)、模型组(n=8)。术后第5周开始给药，高、中、低剂量葛根素组分别以葛根素100 mg/kg、50 mg/kg、25 mg/kg腹腔注射;卡托普利组以卡托普利(30 mg/kg)灌胃;假手术组与模型组以等量生理盐水灌胃。连续给药6周，每2周测1次血压。给药6周后，在25%乌拉坦麻醉下腹主动脉取血，离心后取上清液待测apelin、Ang II和NO含量。取出右侧肾脏，用预冷的生理盐水漂洗后滤纸吸干，将右肾的一半置入10%中性甲醛中固定;右肾的另一半用匀浆器碾磨3500 r/min 4℃离心10 min，取上清液待测肾脏组织中apelin和AngⅡ水平。用ELISA法测肾脏、血清中apelin-12含量，放射免疫法测定肾脏、血浆中AngⅡ含量，硝酸还原酶法测血清中NO含量。

6 统计学处理

结 果

1 各组大鼠动脉压的改变

各组间大鼠在术前血压没有明显差异。从表1可知，术后4周RHR组收缩压明显升高，与假手术组比较有明显差异(P＜0.01)，RHR组间差异不显著(P＞0.05)。给药后葛根素高、中剂量组与卡托普利组有明显的降压作用(P＜0.01);葛根素低剂量组在给药4周后开始出现降压效应(P＜0.05)。随着葛根素剂量的升高血压下降越来越明显。葛根素低剂量组与高剂量组及卡托普利组在各个测压时点收缩压均有显著差异。

表1 各组大鼠不同时期收缩压变化Table 1.The changes of systolic pressure in all groups(mmHg..n=8～9)

表1 各组大鼠不同时期收缩压变化Table 1.The changes of systolic pressure in all groups(mmHg..n=8～9)

△△P ＜0.01 vs sham group;*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs model group.Pue:puerarin.

Sham 123.5±8.2 122.4±7.9 124.3±7.8 123.8±6.9 Model 179.4±8.6△△ 182.6±9.5△△ 190.3±9.2△△ 192.4±10.5△△Captopril treatment 30 189.8±11.5△△ 166.4±9.2△△＊＊ 159.7±10.5△△＊＊ 154.7 ±8.9△△＊＊Pue(high)treatment 100 183.4±7.6△△ 162.6±9.7△△＊＊ 157.9±8.7△△＊＊ 153.5 ±10.3△△＊＊Pue(middle)treatment 50 180.6±10.5△△ 169.8±9.2△△＊＊ 162.9±7.3△△＊＊ 159.8 ±8.2△△＊＊Pue(low)treatment 25 182.4±8.8△△ 178.1±9.3△△ 174.6±7.1△△＊ 171.3±9.6△△＊

从表2可知，术后4周RHR组舒张压明显升高，与假手术组比较差异明显(P＜0.01)。RHR组间差异不显著(P＞0.05)。给药后葛根素高、中剂量组、卡托普利组与模型组比较降压作用显著(P＜0.01)。与收缩压情况类似，给药4周后低剂量葛根素亦能降低舒张压(P＜0.05)。高剂量葛根素组与低剂量葛根素组之间有显著差异(P＜0.05)。

表2 各组大鼠不同时期舒张压变化Table 2.The changes of diastolic pressure in all groups(mmHg..n=8～9)

表2 各组大鼠不同时期舒张压变化Table 2.The changes of diastolic pressure in all groups(mmHg..n=8～9)

△△P ＜0.01 vs sham group;*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs model group.

Group Dose(mg·kg-1) 4 weeks after operation 2 weeks after administration 4 weeks after administration 6 weeks after administration Sham 89.7±8.2 90.1±6.2 89.4±7.1 91.2±6.7 Model 136.4±8.2△△ 138.6±6.3△△ 137.3±9.1△△ 140.7±10.3△△Captopril treatment 30 135.8 ±7.2△△ 121.4±9.5△△＊＊ 120.7±8.1△△＊＊ 119.6 ±6.1△△＊＊Pue(high)treatment 100 129.8 ±5.9△△ 118.2±7.3△△＊＊ 120.2±5.9△△＊＊ 118.5 ±8.6△△＊＊Pue(middle)treatment 50 130.6 ±9.6△△ 121.1±5.6△△＊＊ 124.5±6.3△△＊＊ 125.8 ±9.1△△＊＊Pue(low)treatment 25 134.7±7.9△△ 130.1±6.9△△ 129.6±8.4△△＊ 128.3±7.3△△＊

2 各组大鼠血清中apelin－12、NO和血浆中AngⅡ含量

从表3可知，葛根素高、中剂量组以及卡托普利组均能有效降低apelin-12和AngⅡ含量，升高NO含量，与模型组比较，差异有统计学意义(P＜0.01)。葛根素低剂量组血清中apelin-12含量下降不明显，但有统计学意义(P＜0.05)。低剂量葛根素对AngⅡ和NO含量没有明显影响(P＞0.05)。

3 各组大鼠肾脏中apelin－12和AngⅡ含量

从图1可知，模型组肾脏中apelin-12含量明显升高，与假手术组比较，差异显著(P＜0.01)。随着葛根素剂量的升高，肾脏中Apelin-12含量逐渐降低，各葛根素组与模型组比较，均有显著差异(P＜0.01或P＜0.05)。

如图2所示，随着葛根素剂量的增加，肾脏中AngⅡ含量逐渐减少。葛根素高、中剂量组与模型组比较，有明显差异(P＜0.01);葛根素低剂量亦能降低肾脏中AngⅡ含量，与模型组比较，差异有统计学意义(P＜0.05)。

表3 各组大鼠血清中apelin－12、NO和血浆中AngⅡ含量Table 3.Content of apelin-12，NO in serum and AngⅡ in plasma in all groups(.n=8～9)

表3 各组大鼠血清中apelin－12、NO和血浆中AngⅡ含量Table 3.Content of apelin-12，NO in serum and AngⅡ in plasma in all groups(.n=8～9)

△P ＜0.05，△△P ＜0.01 vs sham group;*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs model group.

Group Apelin-12(ng·L-1)AngⅡ(ng·L-1)NO(mol·L-1)Sham 186.8±11.5 212.3±10.5 52.3±9.5 Model 225.6±9.6△△ 262.1±9.7△△ 35.6±7.9△△Captopril treatment 194.7±8.4＊＊ 225.6±8.3＊＊ 50.3±6.7＊＊Pue(high)treatment 189.3±12.6＊＊ 220.2±10.1＊＊ 51.4±8.8＊＊Pue(middle)treatment 203.1±7.5＊＊ 234.5±11.3＊＊ 46.7±6.9＊＊Pue(low)treatment 212.4±10.3△△＊ 249.1±9.2△△ 41.8±5.2△

Figure 1.Apelin-12 level in kidneys in all groups..n=8～9.△△P ＜0.01 vs sham group;*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs model group.图1 各组大鼠肾脏中Apelin－12的含量

Figure 2.AngⅡlevel in kidneys in all groups..n=8～9.△△P ＜0.01 vs sham group;*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs model group.图2 各组大鼠肾脏中AngⅡ的含量

讨 论

肾性高血压是一种常见的继发性高血压，其主要病因是肾动脉狭窄。由于肾血流量的减少，异常激活RAS［11］，导致钠、水潴留，引起血压升高。葛根素具有改善心脑血管循环、降压等作用。本实验室以前的实验结果［6］显示葛根素有明显的降压效果。可葛根素剂量与吴文华等［12］报道的偏大，这次所使用的葛根素剂量有所下降，结果表明，葛根素各剂量组均能有效降低血压，收缩压比舒张压的降低程度更加明显，而且随着剂量的增加降压效果越来越显著。其降压幅度与吴文华等实验结果基本相同。与本实验室上次使用的葛根素降压效果也大致相似，产生这种现象的原因可能与动物的性别(上次为雌雄各半，本次均为雄性)、个体差异(不同批次的动物)有关。

血管紧张素转化酶既可以水解血管紧张素，又可以降解apelin。Apelin虽不能与AT1受体直接结合，但APJ受体与AT1受体存在着密切关系，它们既有拮抗作用又有协同作用。Apelin是小分子活性多肽，在血管［13］、心脏［14-15］、大脑［16］中都有表达。Apelin可以调节血管的收缩功能，随着AngⅡ浓度升高，apelin浓度会相应升高，拮抗AngⅡ的升压作用;AngⅡ浓度降低，apelin浓度也会相应降低。目前研究apelin的作用大多测量它在组织器官中的表达水平，本课题组从北京博奥森生物技术有限公司购买了大鼠apelin-12 ELISA检测试剂盒，测出血清及肾脏中apelin的含量。结果表明，模型组与假手术组比较，前者肾脏及血清中apelin-12含量、肾脏及血浆中AngⅡ含量升高，而血清中NO含量降低。随着葛根素剂量的增加，降压效果越来越明显，同时，肾脏和血浆(或血清)中apelin-12和AngⅡ的含量逐渐降低，血清中NO的含量逐渐升高。这提示apelin-12与AngⅡ之间的相互拮抗作用以及NO的升高对降低血压起了一定程度的作用。因此，我们认为葛根素对肾性高血压大鼠的降压作用与其改变大鼠体内apelin-12、AngⅡ和NO的含量及其平衡有关。但它们之间究竟是如何相互作用及其生理病理意义有待进一步研究。

综上所述，葛根素对肾性高血压大鼠具有降压作用，其作用机制可能与其改变大鼠体内apelin-12、AngⅡ和NO的含量及其平衡有关。

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