二甲双胍对高脂饮食诱导的胰岛素抵抗大鼠LPIN1表达及AMPK通路的作用*

庄向华，刘元涛，倪一虹，孙福敦，陈诗鸿

(山东大学第二医院内分泌科，山东 济南 250033)

脂肪组织作为一种内分泌器官，可分泌多种脂肪因子如瘦素、抵抗素、脂联素、内脂素等，在糖脂代谢调节过程中发挥重要的作用［1］。LPIN1蛋白是一种新发现的基因LPIN1表达蛋白，在fld小鼠中基因缺失，其作用缺陷可以导致脂肪细胞分化障碍、糖代谢受损、高脂血症［2］。动物研究表明LPIN1基因表达与肥胖、胰岛素抵抗负相关。LPIN1的生理学作用目前尚未完全明确。

腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)是一种重要的蛋白激酶，能调节能量代谢，被称为“能量感受器”。除调节机体能量代谢外，AMPK也参与机体胰岛素敏感性的调节。研究发现，AMPK基因剔除可诱导小鼠胰岛素抵抗;而AMPK过表达或AMPK特异性激活剂均具有胰岛素增敏效应［3］。二甲双胍可以激活AMPK信号通路，抑制肝脏的糖异生，促进脂肪酸氧化，改善胰岛素敏感性。本课题从肝脏胰岛素抵抗发病机制出发，通过高脂喂养诱导大鼠产生胰岛素抵抗(insulin resistance，IR)，观察大鼠肝脏LPIN1和AMPKα表达、活性的变化。造模成功后应用二甲双胍进行干预，探讨LPIN1在胰岛素抵抗发生过程中可能的作用机制。

材料和方法

1 动物

雄性Wistar大鼠36只，购于山东大学医学院实验动物中心，体重160～200 g，动物的饲养遵照山东大学医学院伦理委员会规定。给予标准饲料，自由取食和饮水。适应性饲养1周后，按体重随机分为2组:对照组(control，Con组)12只，给予大鼠食用的标准饲料，含有5%的脂肪、53%碳水化合物、23%蛋白质，热量含量为25 kJ/kg;高脂饲养组(high-fat diet，HF组)24只，给予高脂饮食，含有22%脂肪、48%碳水化合物以及20% 蛋白质，热量含量为44.3 kJ/kg［4］。高脂饮食饲料购自北京科奥协力饲料有限公司。每周监测大鼠体重和血糖。实验组喂养8周后将高脂组大鼠随机分为高脂(HF)组12只和二甲双胍干预(metformin intervention，MET)组12只，2组除继续喂以高脂饲料外，MET组用二甲双胍灌胃，剂量为200 mg·kg-1·d-1，每周称重1次，据此调整剂量;Con组应用标准饲料继续喂养8周。第16周末再次行钳夹实验评价各组IR情况。大鼠过夜空腹12 h，钳夹实验前颈动脉取血测定血糖，并分离血清于-70℃保存用于生化指标检测;钳夹实验结束后处死动物，留取肝脏标本-70℃保存备用。

2 高胰岛素－正葡萄糖钳夹实验［5］

实验前4～5 d在麻醉下行颈动脉和颈静脉埋植式插管术，在动物清醒、自由活动状态下行钳夹实验。将诺和灵R以13mU·kg-1·min-1的速度持续泵入，每10 min监测1次血糖，保持血糖在4.5～5.5 mmol/L范围内，达到稳态，进行120 min，计算葡萄糖输注率(glucose infusion rate，GIR)。

3 生化指标检测

大鼠尾静脉取血，离心后分离血清，将血清样品放入低温冰箱中保存，供测定时使用。血糖测定采用葡萄糖氧化酶法，使用美国强生公司(Life Scan)强生稳豪型OneTouch UltraEasy血糖仪。血清胰岛素采用放射免疫法测定(Linco Research)。血清总胆固醇(total cholesterol，TC)、甘油三酯(triglyceride，TG)水平应用Beckman DXC 800型生化自动分析仪测定。

4 肝脏TG和TC含量分析

［6］方法进行，组织经氯仿/甲醇抽提后用全自动生化分析仪测定。称取100 mg组织标本放入1 mL氯仿/甲醇(体积比为2∶1)中，用电动匀浆器匀浆。匀浆移入干净试管中，在室温下摇动过夜，然后加入1 mL 0.6%氯化钠混匀，2000 r/min离心15 min使水与有机界面分开，底层的氯仿层小心移入玻璃管，用氮气吹干后再溶于适量乙醇中，用全自动生化分析仪(Beckman)测定。

5 实时定量real－time PCR方法检测基因表达

应用实时定量 PCR检测 LPIN1、AMPKα1、AMPKα2和β-actin mRNA的表达。采用Trizol试剂(Invitrogen)提取总RNA，取100 mg左右的肝脏组织，按照说明书操作，RNA于紫外分光光度计定量后于-80℃储存备用。采用反转录反应试剂盒合成cDNA，按照说明书操作。PCR反应条件:95℃3 min，93 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，40个循环;72℃ 10 min。于每个循环延伸反应最后时刻收集荧光信号。熔解曲线设置:95℃ 1 s，60℃ 2 min，以0.2℃/s的升温速度升温至95℃，升温时连续收集荧光信号。应用实时荧光定量PCR仪(ABI Prism 7500 Detection System)检测。PCR引物由上海生物工程公司合成，引物设计如下:AMPKα1正义链5'-CATTCTTGGTTGCCGAAACA-3'， 反义链5'-TGTTTGGATTTCTGTGGGTT-3';AMPKα2正义链5'-TGTAAACACGGGAGGGTTGAA-3'，反义链5'-GGCAGACAGAATCTGCTGGAA-3';LPIN1正义链5'-CGCCAAAGAATAACCTGGAA-3'，反义链 5'-TGAAGACTCGCTGTGAATGG-3';β-actin正义链5'-TGGTGGACCTCATGGCCTAC-3'，反义链5'-CAGCAACTGAGGGCCTCTCT-3'。

6 Western blotting方法检测蛋白水平表达

在冰冻缓冲液中研碎肝脏组织，提取蛋白，在4℃ 20000 r/min离心20 min，小心吸取上清，用BCA法，用标准蛋白拟合曲线，计算蛋白浓度，确定上样量。取50 μg蛋白在95℃温度下变性5 min，SDS-PAGE电泳并转移到PVDF膜。封闭1 h，应用p-AMPKα (Thr172)(Santa Cruz)、AMPKα1、AMPKα2(Abcam)和 LPIN1(Santa Cruz)抗体孵育，加5 μLⅡ抗(1∶2000稀释)与10 mL封闭缓冲液中充分混匀，加入硝纤膜。取出硝纤膜放入发光液，反复浇硝纤膜约5 min，取出硝纤膜，吸干过多液体，保鲜膜包裹硝纤膜，置于曝光盒中曝光、显影、定影。GAPDH为内参照，用多功能数字图像分析仪Kodak Digital Science ID软件进行分析。

7 统计学处理

结 果

1 一般情况和体重变化

实验组大鼠给予高脂饮食后，HF组大鼠与Con组相比，体重、空腹血糖、空腹胰岛素显著增高。血浆中和肝脏内TG、TC水平明显升高(P＜0.01)。HF组动物 GIR值［(18.80±1.57)mg·kg-1·min-1］较 Con 组 ［(24.31 ±2.65)mg·kg-1·min-1］显著降低(P＜0.01)，提示存在胰岛素抵抗。应用二甲双胍进行干预后，MET组体重、空腹胰岛素、空腹血糖、TG和TC水平均较HF组下降，有显著差异。MET组GIR值［(21.35±1.26)mg·kg-1·min-1］较HF组显著提高(P＜0.05)，提示胰岛素抵抗较HF组改善，见表1。

表1 3组大鼠体重、血清学指标以及肝脏脂肪含量的变化Table 1.Changes of body weight，serum indexes and hepatic lipid profiles in the three groups(.n=12)

表1 3组大鼠体重、血清学指标以及肝脏脂肪含量的变化Table 1.Changes of body weight，serum indexes and hepatic lipid profiles in the three groups(.n=12)

*P ＜0.05，＊＊ P ＜0.01 vs Con group;#P ＜0.05，##P ＜0.01 vs HF group.Con:control;BW:body weight;FBS:fasting blood sugar;FINS:fasting insulin;TG:triglyceride;TC:total cholesterol;GIR:glucose infusion rate;HF:high fat;MET:metformin.

Group BW(g)FBS(mmol/L)FINS(mU/L)TG(mmol/L)TC(mmol/L)GIR(mg·kg-1·min-1)TG in liver(mmol/g)TC in liver(mmol/g)Con 360±15 5.10±0.44 19.35±6.38 0.83±0.39 1.14±0.24 24.31±2.65 0.48±0.28 0.26±0.08 HF 438±24＊＊ 7.07±1.61* 23.70±7.37* 3.21±1.44＊＊ 3.04±1.62＊＊ 18.80±1.57＊＊ 0.89±0.31＊＊ 0.46±0.20＊＊MET 380±18# 6.32±0.95# 18.19±4.27# 1.36±0.24## 1.85±1.39# 21.35±1.26# 0.57±0.29# 0.31±0.18#

2 LPIN1(mRNA和蛋白)表达

与对照组相比，HF组大鼠肝脏组织中LPIN1 mRNA表达水平显著降低(P＜0.01)，LPIN1蛋白表达水平减少(P＜0.01)。应用二甲双胍干预后，大鼠LPIN1 mRNA表达水平较HF组增加(P＜0.01);LPIN1蛋白表达水平增加(P＜0.01)，见图1、2。

Figure 1.The mRNA expression of LPIN1，AMPKα1 ，and AMPKα2.＊＊P ＜ 0.01 vs Con group;▲▲P ＜0.01 vs HF group.图1 LPIN1、AMPKα1和AMPKα2 mRNA表达

Figure 2.LPIN1 expression in rat livers in the three groups.＊＊P＜ 0.01 vs Con group;▲▲P＜0.01 vs HF group.图2 3组大鼠中肝脏LPIN1蛋白表达

3 AMPKα(mRNA和蛋白)和 p－AMPKα活性变化

3组大鼠肝脏组织AMPKα1和AMPKα2 mRNA和蛋白表达均无显著差异。与Con组大鼠相比，HF组大鼠p-AMPKα(Thr-172)蛋白表达显著降低(P＜0.01);与HF组相比，应用二甲双胍干预后p-AMPKα(Thr-172)的表达明显增加(P＜0.01)，见图 1、3。

Figure 3.AMPKα1，AMPKα2 and p-AMPKα expression in rat livers in the three groups.＊＊ P ＜ 0.01 vs Con group;▲▲P ＜0.01 vs HF group.图3 3组动物肝脏中 AMPKα1、AMPKα2和 p－AMPKα蛋白表达

讨 论

Lipin是双向调控身体脂肪代谢的一个家族，由脂素基因(LPIN)所表达产生，包括LPIN1、LPIN2和LPIN3。LPIN1在脂肪组织、肝脏、骨骼肌、心脏等多种组织表达［7］，在脂质合成和基因表达方面有双重作用，一是作为磷脂酸磷酸酶 (PAP)1发挥促进甘油三酯、磷脂合成作用;二是作为转录协同刺激因子联系肝过氧化物酶体增殖物活化受体(PPAR)γ协同刺激因子1α(PGC1α)和PPARα，调节脂肪酸利用和脂肪合成基因表达［7-8］。研究证明LPIN1和胰岛素抵抗密切相关，aP2转基因鼠中LPIN1的表达和胰岛素敏感性有关，其肝脏和脂肪组织中LPIN1表达水平与血浆胰岛素浓度负相关，而给予HepG2细胞中高胰岛素环境后LPIN1表达下调［8］。芬兰的研究发现人类脂肪组织中LPIN1 mRNA表达水平与血糖、胰岛素、胰岛素抵抗等负相关［9］。健康男性中的LPIN1 mRNA与运动过程中呼吸商、氧消耗等相关，与脂肪酸代谢相关蛋白包括PPAR等表达正相关［10］。Harris等［11］研究发现在胰岛素信号通路中LPIN1是下游靶基因，在胰岛素的刺激作用下，LPIN1蛋白丝氨酸、苏氨酸位点磷酸化。

肝脏是能量代谢的重要器官，也是胰岛素作用的主要靶器官，维持空腹状态下内生性糖的产生和输出、进食后糖的吸收、利用和存储。本研究采用高脂饮食造模，显示与对照组相比，高脂组大鼠体重、空腹血糖、胰岛素、血浆和肝脏中TG、TC水平显著升高。应用高胰岛素-正葡萄糖钳夹实验评价胰岛素抵抗，结果提示高脂饮食组大鼠的GIR显著降低(P＜0.01)，LPIN1表达明显下调;应用二甲双胍干预后GIR值明显增加，胰岛素抵抗改善，而LPIN1表达水平也显著增加，提示LPIN1与胰岛素抵抗可能存在相关性。

具有胰岛素增敏作用的口服降糖药物二甲双胍，近年来被证实为AMPK激活剂。它可通过激活AMPK抑制肝糖异生，脂质合成，促进肌肉对葡萄糖的摄取和利用。在肝细胞中二甲双胍首先激活AMPK，AMPK中α亚单位(包括α1和α2)是催化亚单位，α亚基上172位苏氨酸磷酸化后，可使乙酰辅酶A羧化酶失活，减少胞浆内丙二酰辅酶A的含量，促进细胞内脂肪酸氧化，调节细胞内糖脂代谢，Liu等［12］发现长期高脂环境可以显著降低大鼠骨骼肌AMPKα表达和活性，证实AMPKα参与高脂环境诱导胰岛素抵抗发生的机制。而本研究显示高脂组大鼠肝脏中AMPKα表达无明显改变，p-AMPKα(Thr-172)磷酸化水平显著降低，二甲双胍干预后p-AMPKα(Thr-172)表达水平较高脂组显著增加，提示在胰岛素抵抗发生以及二甲双胍干预过程中主要是AMPKα活性的改变，与文献资料［1］相符。许多脂肪因子，如瘦素、脂联素，可通过AMPK在骨骼肌和肝脏中发挥作用。瘦素在外周组织通过AMPK活化而增加葡萄糖的摄取［13］。脂联素改善代谢的过程与肝脏中AMPK激活进而减少脂肪酸合成，增加线粒体脂肪酸氧化等有关［14］。LPIN1作为一种新的脂肪因子，与胰岛素抵抗相关，除了已知的上述两方面作用机制以外，是否与AMPK通路有关?目前此方面研究较少。Higashida等［15］应用 AMPK激活剂AICAR处理大鼠股三头肌6 h后，LPIN1 mRNA表达水平显著增加。我们的研究结果显示高脂动物模型中，应用AMPK的另一种激活剂二甲双胍干预后AMPKα活性明显改善，肝脏LPIN1基因以及蛋白表达均较 HF组明显增加，进一步提示大鼠肝脏中LPIN1在AMPK信号通路中可能存在作用，AMPK信号通路的激活可以增加LPIN1表达水平，进而调节糖脂代谢，在胰岛素抵抗发生发展过程中起到调控作用。

总之，本研究证明在饮食导致的肥胖大鼠肝脏中LPIN1蛋白表达、p-AMPKα(Thr-172)磷酸化水平减少，二甲双胍干预后二者表达水平增加。然而，该研究也存在一些不足之处。首先，LPIN1 mRNA通过选择性剪接产生2个蛋白质异构体LPIN1α和LPIN1β，它们在不同位点共同调节糖脂代谢［2］。本研究中的引物和抗体不能区别2种异构体。另外，本研究在基因和蛋白表达水平提示LPIN1可能在AMPK信号通路中存在潜在作用，未来研究可通过转基因或基因沉默方法进一步验证LPIN1和AMPK信号通路之间的确切调控机制。

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