小鼠血清补体替代途径溶血活性测定的新方法

孙黔云，叶巧玲，闫银萍

(贵州省中国科学院天然产物化学重点实验室，贵州贵阳 550002)

补体是免疫系统的重要组成部分，在机体防御、免疫调控中发挥着重要作用［1－3］。但补体在一定病理生理条件下的过度激活会引发炎症和病理损伤［4－6］，尤其是补体的替代途径在多种疾病和病理损伤中扮演了重要角色［7－8］。在这类补体相关疾病和病理损伤研究中，多采用小鼠构建动物模型进行研究。但由于小鼠血清补体的特殊性，采用标准的补体溶血活性测定方法无法测出其经典途径的溶血活性，而替代途径的溶血活性即使能测出，也比较低［9－10］，且所需要的血清量对小鼠实验来说无法承受。因此，构建可用于小鼠血清补体活性测定的新方法具有现实意义。本实验室因开展补体抑制剂筛选评价工作需要，以3个常用品系小鼠的血清补体作为测定材料，采用眼镜蛇毒因子(cobra venom factor，CVF)构建了一种灵敏度高的小鼠血清补体替代途径溶血活性测定的新方法。

1 材料与方法

1.1 主要试剂及材料 眼镜蛇毒采集于湖南省武陵山区;蛋白分离凝胶和预装纯化柱购自瑞典Amersham Pharmacia Biotech公司;兔抗绵羊红细胞抗体(溶血素)、乙二醇双(2-氨基乙醚)四乙酸(ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N，N，N'，N'-tetraacetic acid，EGTA)、明胶购自美国 Sigma 公司;其它试剂均为符合实验要求的国产或进口分析纯。绵羊红细胞、兔红细胞和豚鼠红细胞均采自贵阳医学院实验动物中心提供的实验动物，采集的无菌血液经玻珠脱纤维处理后保存于无菌阿氏液中，存放于4～8℃备用。96孔板为德国Greiner公司产品。

1.2 实验动物 SPF级KM小鼠、BALB/c小鼠和C57BL/6小鼠，体质量18～22 g，由第三军医大学实验动物中心提供，合格证号SCXK(渝)2007-0003。动物实验和动物福利符合相关动物实验管理条例。实验动物饲养于清洁、恒温、恒湿的环境中，实验前均自由进食和进水。

1.3 仪器 AKTA prime蛋白纯化仪、GeneQuant紫外分光光度计(瑞典Amersham Pharmacia Biotech公司);Bio-Rad 550酶标仪(美国Bio-Rad公司);5810R冷冻离心机(德国Eppendorf公司);Revco超低温冰箱(美国Thermo公司)。Milli Q超纯水系统和Elix纯水系统(美国Millipore公司)。

1.4 方法

1.4.1 血清制备 分别取KM、BALB/c和C57BL/6品系♀、♂小鼠各20只，制备每一品系小鼠单一性别的混合血清。采用戊巴比妥钠腹腔麻醉小鼠，打开腹腔，经腹主静脉取血，抽取的血液置于试管中，室温放置1 h，然后置于4℃放置3 h，在4 ℃条件下，2 000 r· min－1离心10 min，吸取血清，混匀，分装，冻存备用。正常人血清是由本实验室健康志愿者献血制备的混合血清。制备的血清均保存于－80℃。每管冻存的血清只在临用前取出化冻1次，化冻后未用完血清不再使用。

1.4.2 两种抗补体蛋白的制备 CVF的分离纯化和激活补体替代途径的活力单位测定分别参照文献［11－12］进行。新型补体抑制蛋白Atrase B的制备和补体抑制活性的检测参照文献［13］进行。制备的CVF和Atrase B冻存于－80℃，备用。

1.4.3 小鼠血清补体经典途径溶血活性测定 参照文献方法［14］，有改动。取适量冻存血清，室温水浴快速化冻，用葡萄糖明胶巴比妥缓冲液(GGVB)分别稀释成1∶2、1∶5、1∶10、1 ∶20 的稀释液，取 100 μl稀释血清与 100 μl致敏绵羊红细胞悬液(5×1011cells·L－1，用 GGVB 配制)混匀，37℃水浴30 min，期间不时轻轻振摇，孵育完毕，加入1 ml冷生理盐水终止反应，2 000 r·min－1离心 10 min。取 200 μl上清液加入96孔板，于酶标仪405 nm处测定吸光度。以正常人血清为实验体系质控血清。

1.4.4 小鼠血清补体替代途径溶血活性测定 参照文献方法［13］，有改动。分别取 20、40、60、80、100 μl化冻血清(不足100 μl者，以明胶巴比妥缓冲液(GVB)补足)，与 100 μl Mg-EGTA 2 × 缓冲液(含 4 mmol·L－1Mg2+和 16 mmol·L－1EGTA的GVB)混合，再与100 μl兔红细胞悬液(1.5×1011cells·L－1，以含 2 mmol·L－1Mg2+和8 mmol·L－1EGTA 的GVB配制，以下均同)混匀，37℃水浴30 min后，加入0.5 ml冷生理盐水终止反应，离心，取300 μl上清液加入96孔板，于405 nm测定吸光度。以正常人血清为实验体系质控血清。

1.4.5 CVF激发的小鼠血清替代途径溶血 取不同量化冻血清(不超过 50 μl，以 GVB 补足至 90 μl)，与 100 μl Mg-EGTA 2×缓冲液、100 μl兔红细胞悬液混合，再加入 10 μl不同浓度的CVF，混匀，37℃水浴30 min后，加入0.5 ml冷生理盐水终止反应，离心后按上述方法测定吸光度。

1.4.6 两种抗补体蛋白对小鼠体内血清补体活性影响的测定 通过尾静脉注射，分别将CVF以0.02 U·g－1的剂量、Atrase B 以 20 μg·g－1和 40 μg·g－1的剂量给予对应组别的BALB/c♂小鼠。通过眼眶采血，分别制备给药前和给药后不同时间点的血清，采用本实验构建的测定方法测定不同时间点血清补体的替代途径溶血活性的变化。

2 结果

2.1 小鼠血清补体经典途径溶血活性 KM、BALB/c和C57BL/6品系小鼠的血清在1∶20、1∶10、1∶5甚至1∶2的稀释度下均未发生经典途径的溶血(数据未列出)。

2.2 小鼠血清补体替代途径溶血活性 KM、BALB/c和C57BL/6品系小鼠的血清均能产生一定程度的替代途径溶血，但要达到合适的溶血度，单次测定则普遍需要约100 μl以上的血清量(Fig 1)。

2.3 CVF激发的小鼠血清补体替代途径溶血 采用CVF激活小鼠血清补体替代途径，可以明显提高其替代途径的溶血度(Tab 1)。

2.4 抗补体蛋白体内活性测定 采用构建的新方法，成功

测定了给药后小鼠体内血清补体活性的变化(Fig 2)。

3 讨论

补体是免疫系统的重要组成部分，其功能由补体成分组成的不同活性反应链来实现。因此，测定相关补体活性对于评价补体功能状态和反映补体在一系列相关疾病和病理损伤中的作用和变化具有重要的意义和价值。而采用抗原抗体识别原理的免疫化学或酶联免疫吸附测定方法往往无法分辨和识别正常补体蛋白与失活的补体蛋白、补体活化产物与完整蛋白的区别，其测定结果无法取代补体功能测定实验。

本实验对3个常用品系小鼠KM、BALB/c、C57BL/6的血清补体活性进行测定，结果表明，采用标准的补体溶血活性实验无法检测出小鼠血清补体的经典途径溶血活性，而小鼠血清补体的替代途径溶血活性，即使能测出，也需要较多的血清，从而无法开展小鼠血清补体活性的测定。

Tab 1 Hemolytic activity of mouse serum complement challenged by CVF(%，n=6)

CVF是存在于眼镜蛇毒中的一种高度特异的补体激活蛋白。在血清中，CVF与补体B因子特异结合，形成CVFB复合物，经D因子的识别和酶切作用，转化成补体替代途径C3/C5转化酶CVFBb，CVFBb不受内源性补体调控蛋白的影响，可持续激活补体替代途径，从而造成替代途径成分的消耗。采用CVF激活补体，可有效提高补体激活效率，使补体活化反应充分，从而可最大限度地提高补体活性变化的检出灵敏度。本实验经过筛选，确定加入的CVF合适剂量为1 U。对于♂C57BL/6和♂BALB/c小鼠而言，采用本方法只需要5～10 μl血清即可以获得理想的溶血度;而对于KM小鼠，使用10～20 μl血清也可以获得理想的溶血度，大大降低了血清使用量。只需较少的血清就可完成单次或多次重复测定，也使得测定小鼠血清补体的替代途径溶血活力单位(APH50)具有了可行性。通过优化该方法的测定条件，还可进一步减少血清用量。另外，从新方法的测定结果中可以看到，在同等条件下，KM小鼠血清补体活力明显低于♂C57BL/6和♂ BALB/c小鼠血清补体活力。KM小鼠品系是我国科研工作者引进瑞士种小鼠培育而成，而文献报道瑞士种小鼠血清补体活力明显低于 BALB/c等品系小鼠［9－10］。因此，本方法测得的不同小鼠品系间的血清补体活力高低结果也从小鼠品系来源上得到了印证。同时，从本结果中还可看出，本实验中使用的3个小鼠品系，尤其是C57BL/6和BALB/c小鼠，其♀鼠的血清补体活性显著低于♂鼠的血清补体活性。国外也报道了BALB/c小鼠和Swiss小鼠的杂交后代中♂小鼠的血清补体活性明显高于♀小鼠［9－10］。这一结果提示，在应用小鼠模型进行补体相关疾病和免疫损伤的研究时，也应注意到在补体活性上存在的性别差异。

Fig 1 Hemolytic activity of the alternative pathway of serum complement from three mouse strains(n=3)

Fig 2 Serum complement activity in mice after a single i.v.injection of anticomplementary protein

本文采用CVF构建了简便、灵敏、微量、实用的小鼠血清补体替代途径溶血活性测定的新方法，为小鼠血清补体活性的测定提供了有效实用的技术方法和有益的参考。

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