槲皮素抑制诱导型一氧化氮合酶减轻脓毒症大鼠的心肌损伤

张 弛，黄 靓，屈顺林，唐志晗，韦 星

(南华大学1.心血管病研究所、2.机能学实验中心、3.外科学总论教研室，湖南 衡阳 421001)

脓毒症是一种由严重感染引起的全身炎症反应综合征，可以造成全身多种脏器的损伤，其中心脏就是重要的受损靶器官之一［1］。脓毒症心肌损伤的主要表现有心脏收缩功能下降、心律失常等。研究表明，脓毒症导致的心肌损伤与诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)的过表达有关，在iNOS的作用下大量一氧化氮(nitric oxide，NO)的产生，导致心肌功能障碍的发生和发展［2］，而将iNOS基因剔除则能减轻内毒素诱导的脓毒症模型小鼠的心肌损伤［3］。槲皮素是一种在植物中广泛存在的黄酮类化合物，具有多种生物学作用［4－5］，如心血管保护、抗肿瘤、抗炎、抗血小板聚集和清除自由基等。多项研究表明，槲皮素是通过抑制iNOS的活性，减少前炎症因子NO的释放而发挥抗炎作用［6－7］。由于目前尚未见有关槲皮素对脓毒症心肌保护作用的相关文献报道，因此本研究拟采用盲肠结扎穿刺法(cecal ligation puncture，CLP)制备大鼠脓毒症模型，通过血流动力学指标的检测，观察槲皮素对脓毒症大鼠的心脏保护效应，并结合心肌组织iNOS蛋白表达、活力检测与心肌组织NO含量测定初步探讨其作用机制。

1 材料与方法

1.1 动物分组与处理 SPF级♂SD大鼠30只，体质量(200±20)g，由南华大学实验动物部提供。随机分为3组，每组10只。槲皮素预处理组(QCT):将质量分数为1×10－3的槲皮素(购自Sigma公司，Q4951)均匀混合于鼠饲料中，按每只大鼠日平均进食 100 g·kg－1计算，槲皮素剂量为 0.1g·kg－1，给药7 d后，麻醉状态下行盲肠结扎穿刺术制备脓毒症模型;脓毒症组(CLP):按平均日进食100 g·kg－1给予普通鼠饲料喂养，7 d后，麻醉状态下行盲肠结扎穿刺术制备脓毒症模型;假手术组(Sham):麻醉状态下，腹壁正中切开2～3 cm，不行盲肠结扎穿刺术，然后逐层关闭腹腔，其余操作同脓毒症组。

1.2 盲肠结扎穿刺术 SD大鼠在标准饲养条件下适应1周。用质量分数为0.1的水合氯醛300 mg·kg－1经腹腔注射麻醉SD大鼠，消毒腹壁皮肤后，取腹壁正中切口2～3 cm，小心拉出盲肠。将升结肠中的粪便挤入盲肠中，使盲肠进一步充盈，在盲肠血管弓内距盲肠盲端1～1.5 cm处结扎，避免损伤血管。用18号针头于盲肠盲端对合穿孔3次。轻轻挤压结扎的盲肠，挤出少量粪便内容物。观察肠段无活动性出血后将盲肠还纳入腹腔，逐层关闭腹腔。术后立即皮下注射生理盐水30 ml·kg－1，进行液体复苏。

1.3 血流动力学指标监测 盲肠结扎穿刺术后12 h，经右颈总动脉左心室内插管，连接PowerLab System分析系统(澳大利亚AD instruments公司)，使用血流动力学分析软件包监测平均动脉压(mean arte-rial pressure，MAP)、左心室收缩压(left ventricular systolic pressure，LVSP)、左心室舒张末期压(left ventricular end-diastolic pressure，LVEDP)、左心室等容收缩期压力上升的最大速率(+dp/dtmax)及左心室等容舒张期压力下降的最大速率(－dp/dtmax)。

1.4 免疫印迹法测定iNOS蛋白表达 取左心室心肌组织，用预冷的PBS洗净余血，然后置于玻璃匀浆器中，并加入适量RIPA裂解液(RIPA裂解液购自碧云天生物技术研究所)，4℃匀浆。13 000 r·min－1，4℃离心 20 min，取上清液。BCA 法进行蛋白定量。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离组织匀浆中的蛋白，再转移至PVDF膜，用质量分数为0.05的牛血清白蛋白室温封闭2 h后，加入iNOS多克隆抗体(Stressgen，KAS-NO001)检测心肌组织iNOS的蛋白表达。以大鼠心肌组织GAPDH的蛋白表达量作为内参照(GAPDH单克隆抗体购自Cell Signaling Technology，2118)。

1.5 心肌组织匀浆中NO含量及iNOS活力的测定 取左心室心肌组织100 mg，加入0.9 ml预冷的磷酸盐缓冲液(pH 7.4)，于冰水浴中用匀浆器制备组织匀浆。5 000 r·min－1，4℃离心15 min，取上清液备用。采用南京建成生物工程研究所NO测试盒和NOS分型测试盒分别测定NO浓度和iNOS活力，操作按照试剂盒说明书进行。

1.6 统计学分析 采用SPSS 13.0统计软件，计量资料用±s表示，多组间比较采用单因素方差分析。

2 结果

2.1 左心室血流动力学变化 如Tab 1所示:与Sham组比较，CLP组大鼠LVSP降低、LVEDP升高、+dp/dtmax与 －dp/dtmax均有所下降(P ＜0.01，差异具有显著性)，这些血流动力学指标说明CLP组大鼠心脏功能发生了明显损害;而QCT组大鼠与CLP组大鼠比较，LVSP、LVEDP、+dp/dtmax与 －dp/dtmax等血流动力学指标均有不同程度改善，说明槲皮素预处理可以减轻脓毒症大鼠的心脏功能损害。

Tab 1 Hemodynamic measurements in rats from three groups(n=6)

2.2 左心室心肌组织iNOS蛋白表达 为探讨槲皮素保护脓毒症大鼠心脏功能的可能机制，我们通过Western blot检测了各组大鼠左心室心肌组织iNOS的表达。结果如Fig 1所示:CLP组大鼠左心室心肌组织iNOS的表达上调，与Sham组比较(P＜0.05)，差异具有显著性;而QCT组大鼠左心室心肌组织iNOS的表达较之Sham组升高(P＞0.05，差异无显著性)，但却明显低于 CLP组的水平(P＜0.05)，差异具有显著性。

Fig 1 Effects of quercetin on myocardial iNOS protein expression(n=3)

2.3 心肌组织匀浆中iNOS活力、NO含量的变化

各组大鼠左心室心肌组织iNOS表达的改变，提示脓毒症心肌损害可能与其有关。进一步的实验中，我们检测了心肌组织匀浆中iNOS活力、NO含量的变化(Tab 2)。CLP组大鼠心肌组织匀浆中，iNOS的活力升高，NO的含量增加，与Sham组大鼠比较(P＜0.05)，差异具有显著性;而QCT组大鼠心肌组织匀浆中，iNOS活力与NO含量的增加幅度较小，与Sham组大鼠比较(P＞0.05)，差异无显著性。

Tab 2 Effects of quercetin on myocardial NO levels and iNOS activities(n=6)

3 讨论

脓毒症时炎症因子的泛滥引起全身多个系统的功能障碍和结构损伤，心血管系统也是受累的靶器官之一，尤其是婴幼儿患者，脓毒症心肌损伤更易发生。研究发现，肿瘤坏死因子-α、白介素-1、白介素-6、内皮素-1、黏附分子、NO等均参与了脓毒症心肌损伤的发生过程。NO既是气体分子，也是一个自由基。在生理状态下，低浓度的NO发挥着广泛的生理功能。但是在病理条件如细菌内毒素、炎症因子等的诱导下，iNOS被激活，大量NO持续产生。NO可与超氧阴离子反应生成过氧化亚硝基阴离子，后者是强氧化剂，可造成细胞脂质过氧化、蛋白酪氨酸硝基化、巯基氧化等，介导多种疾病的发生［8］。国外很多研究也证实应用NOS抑制剂或是iNOS基因剔除能够改善脓毒症动物模型的心脏功能［1］。因此，抑制iNOS可能是脓毒症心肌损伤治疗的有效手段之一。

自然界中很多种植物均含有槲皮素。它是一种黄酮类化合物，具有多种生物学作用，人们对槲皮素的抗氧化作用认识较早，也研究得较为深入。研究表明，槲皮素的抗氧化作用主要与其清除活性氧自由基，特别是过氧化亚硝酸盐和羟自由基有关［9］。在实验中，我们发现脓毒症大鼠心肌组织NO含量增加。由于NO能够反应生成过氧化亚硝基阴离子，造成心肌的氧化损伤，因而脓毒症大鼠的心脏功能明显降低。然而，槲皮素预处理组大鼠心肌组织NO含量的增加低于脓毒症组大鼠，心脏血流动力学指标也反映其心脏功能的损伤程度较轻。虽然槲皮素预处理组大鼠心肌组织iNOS的表达及活力，心肌组织NO含量较对照组大鼠增加，但却明显低于脓毒症组大鼠。结果说明过量的NO能够降低心脏功能，而槲皮素能够降低iNOS的表达及活力，抑制NO的过量生成，减轻心脏功能的损伤程度。综上所述，槲皮素通过降低心肌组织iNOS的表达及活力，抑制了脓毒症时心肌组织中过量的NO产生，减轻脓毒症心肌损伤。

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