碱性成纤维细胞生长因子单克隆抗体在小鼠体内药代动力学研究

潘兰红，徐 萌，曾世彬，陈文慧，李汉初，盛良翮，朱新海，向军俭，邓 宁

(暨南大学1.附属第一医院肿瘤科、2.生命科学院抗体工程研究中心，广东 广州 510632)

肿瘤的生长及转移依赖于血管形成，碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)是促血管形成的关键因子［1］，阻断 bFGF活性可有效抑制新生血管的形成，从而抑制肿瘤生长及转移。本实验室通过传统杂交瘤技术获得能够阻断bFGF生物学活性的单克隆抗体(bFGF-mAb)。实验室前期研究表明，bFGF-mAb具有体内外抑制黑色素瘤 B16生长效应［2－3］。bFGF-mAb分别与放疗或化疗联合应用，可提高黑色素瘤对放、化疗的敏感性［4－5］。目前，bFGF-mAb体内代谢动力学特征未见报道。因此，本研究采用放射性核素示踪法和三氯醋酸(TCA)沉淀法，探讨其在小鼠体内的药代动力学特征，以期为新型抗体药物的研发和临床应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器 bFGF-mAb由本实验室制备。弗氏不完全佐剂(美国Sigma公司)，三氯醋酸(上海国药化学制剂有限公司)，125I(北京原子高科有限公司)，Protein G柱(美国GE公司)，Sephadex G-25柱(Pharmacia公司)，γ放射免疫计数仪GC-1200(中国科技大学中佳光电仪器公司)。

1.2 实验动物 BALB/c小鼠76只，♀ 46只，♂30只，体质量18～22 g，7～8周龄，购自南方医科大学实验动物中心(动物许可证号:SCXK粤2006-0015)，动物置于(22±1)℃控温和光暗周期为12 h环境下，饲料由南方医科大学实验动物中心提供。药代动力学实验前3 d开始给小鼠喂食碘化钾封闭甲状腺功能。

1.3 bFGF-mAb制备 弗氏不完全佐剂预免疫BALB/c小鼠16只，0.33 ml/只，复苏、培养本实验室已建株分泌bFGF-mAb的杂交瘤细胞，取对数生长期细胞2×109·L－1的细胞悬液，腹腔注射杂交瘤细胞进入预免疫7 d的小鼠，1 ml/只。7～12 d腹水形成，抽取腹水，经辛酸－硫酸铵初纯化，再以Protein G纯化，BCA法测浓度，ELISA法测其标记前抗体效价，－20℃冻存备用。

1.4125I-bFGF-mAb的制备和稳定性测定 氯氨T法(Ch-T法)制备125I-bFGF-mAb，经sephadex G-25柱纯化，γ放射免疫计数仪测量放射性计数率，纸色谱法测其标记率及放化纯度，ELISA法测其标记后抗体效价，酶联免疫检测仪450 nm处检测各孔的吸光值(OD450nm)，乘以抗体最大稀释倍数即为抗体效价。稳定性测定:bFGF-mAb以125I标记后，置于4℃冰箱保存，分别于d 1、2、4、6和8进行稳定性实验，用纸色谱法测放化纯度，放化纯度=层析纸中125I-bFGF-mAb抗体产品峰的放射性计数率/(125I-bFGF-mAb抗体产品峰的放射性计数率+游离125I峰的放射性计数率)×100%。

1.5125I-bFGF-mAb血药浓度随时间变化的测定24只BALB/c小鼠，♀♂各半，随机分为3组，尾静脉注射125I-bFGF-mAb 0.1ml，各组化学剂量分别为0.5、1.5 和 5 mg·kg－1，在给药后 0.08、0.17 、0.5、1 、2 、4 、12 、24 、36 、48 、72 、96 和144 h 等各个时间点从眶静脉取血，置入肝素抗凝管，加入等体积20%TCA沉淀蛋白，测量总放射性计数，离心后吸出上清，测定TCA沉淀部分放射性计数。计算TCA沉淀率(代表血液中原型药物百分比含量)。放射性计数换算成药物浓度(g·L－1)，绘制出血浆药物浓度 － 时间(c－t)曲线［6－8］。

1.6 药代动力学参数计算 应用药物代谢动力学分析软件(3P97)对静脉给药途径所得到的血药浓度－时间数据进行处理，用Akaikc信息标准(AIC)法和F检验最小原则判断房室模型。

1.7125I-bFGF-mAb脏器的分布特征和样品回收率 36只BALB/c小鼠，♀♂各半，随机分成6组，每组6只，尾静脉注射125I-bFGF-mAb 0.1 ml，注射剂量为 1.5 mg·kg－1，在给药 0.5、2 、6 、24 、48 和96 h后分别处死1组小鼠，取心、肝、脾、肺、肾、胃、大肠、小肠、脑、肌肉、眼、膀胱等脏器，称重W(g)，测量放射性计数，计算每克组织器官放射性计数与总注入剂量的百分比，以%ID/g。然后将各时间点组织器官制成匀浆，TCA沉淀，并测量沉淀前后放射性计数，计算TCA沉淀率。

2 结果

2.1 氯胺T法标记bFGF-mAb125I-bFGF-mAb放射性比活度为1 mg·37 MBg－1，125I-bFGF-mAb 标记物纯化放化纯度≥98%。125I-bFGF-mAb在6 d内4℃冰箱保存放化纯度＞90%，d 8时放化纯度为81.2%，表明125I-bFGF-mAb保存在4℃冰箱宜在1周内使用。ELISA结果示标记前抗体效价为1∶8 284 000，标记后抗体效价为1∶8 037 000，故采用氯胺T法标记不影响bFGF-mAb的生物活性。

2.2125I-bFGF-mAb的药代动力学 静脉注射125I-bFGF-mAb后，3个剂量组的各个时间点小鼠血浆中原型药物浓度随时间变化曲线见Fig 1，用3P97软件计算拟合小鼠药物代谢数学模型，根据F检验和AIC值最小原则综合判断，结果为静脉注射各剂量组的125I-bFGF-mAb，在小鼠体内的药代动力学过程符合三室模型以权重1/CC计算的药时曲线拟合最佳，主要药代动力学参数见Tab 1。各个时间点的TCA酸沉淀部分放射性回收率为(90.8±10.2)%，提示TCA沉淀后的放射性计数可代表原形药物组织含量。

Fig 1 Curve of average plasma concentration of125I-bFGF-mAb vs time after iv injection of a dose of 0.5，1.5，5 mg·kg-1in mice(n=8)

Tab 1 Main pharmacokinetic parameters of125I-bFGF-mAb in mice after iv injection of a dose of 1.5 mg·kg-1(n=8)

2.3125I-bFGF-mAb组织分布特征 单次静脉注射125I-bFGF-mAb，各个时间点原型药物在小鼠体内的分布见Fig 2。125I-bFGF-mAb在小鼠的心、肝和肺等组织器官均有较高浓度积聚，其中以肝和肺积聚最高;而脑和眼睛聚集浓度低。各组织器官的TCA酸沉淀部分放射性回收率为(90.8±10.2)%。

Fig 2 Tissue distribution of125I-bFGF-mAb in mice after iv injection of a single dose of 1.5 mg·kg-1(n=6)

3 讨论

近来研究表明，肿瘤血管生成中起着关键作用的因子为VEGF、bFGF和PDGF及其它们的受体，阻断其通路可以抑制肿瘤的生长，并可减少其复发［9］。越来越多抗血管生成药物应用于治疗肿瘤已经得到了临床证实。如贝伐单抗，舒尼替尼，苏拉替尼和沙利度胺，许多潜在的抗血管生成药物还有待于进一步实验研究［10］。bFGF-mAb主要靶向作用于bFGF/FGFR-1系统，通过阻断bFGF与FGFR结合，阻断下游的信号通路，包括 MAPKs/ERKs、PI3K/AKT和PLCγ/PKC等通路，进而抑制转录因子以及与细胞周期、凋亡、细胞骨架等相关蛋白，发挥抗肿瘤作用。国内外有研究报道，bFGF-mAb可抑制肝癌、肺癌、神经胶质瘤、卵巢癌、膀胱癌、黑色素瘤、鳞状上皮癌、骨肉瘤等多种肿瘤细胞生长［11］。

采用放射性核素示踪法及TCA沉淀法研究rhuMAb VEGF及anti-IL-13单抗在体内药代动力学过程，符合抗体药代动力学的一般特性，半衰期长［12－13］。我们研究发现125I-bFGF-mAb 在单次静脉推注后即刻达到峰浓度，以后浓度迅速下降。125I-bFGF-mAb在小鼠体内的药代动力学符合三室模型。快分布相半衰期α)为 0.1 ～0.2 h，表明125I-bFGF-mAb由血液快速向组织液分布。慢分布相半衰期 (β)为 1.05 ～1.84 h，提示125I-bFGF-mAb从组织液向靶器官(第3室)迅速转移。125I-bFGF-mAb清除相半衰期(γ)为 81.6 ～90.02 h，提示125I-bFGF-mAb在体内清除速率较慢。以上结果表明，125I-bFGF-mAb静脉注射后快速到达靶器官，保证了在病理情况下高表达bFGF的肿瘤组织细胞与放射性核素标记的bFGF-mAb有更多的结合几率，有利于发挥125I-bFGF-mAb介导的核素治疗作用，同时减少对其他组织器官的辐射影响。125I-bFGF-mAb在脑组织中放射性分布低，表明药物不易通过血脑屏障。bFGF-mAb在肺中分布较高，提示其可能有利于发挥抗肿瘤作用。有研究报道，bFGF-mAb抑制小鼠 Lewis肺癌转移及血管新生［14］。bFGF单抗协同替吉奥亦可抑制肺癌 Lewis细胞的增殖及移植瘤血管新生［15］。bFGF-mAb在肝中的分布也较高，是否有利于发挥125I-bFGF-mAb介导的核素治疗肝癌作用，尚需进一步研究。

综上所述，125I-bFGF-mAb药物代谢动力学符合三室模型，静脉注射后能迅速到达富含bFGF的靶器官，肝和肺中浓度较高，在脑和眼中分布较低，具有组织特异性，且药物清除较慢，可能有利于发挥抗肿瘤的生物学效应。尚需进一步研究明确其在肺癌和肝癌中的组织特异性及其相关的生物学效应。

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