血管紧张素Ⅱ1型受体拮抗剂用于脓毒症大鼠的实验研究

廖丽君，郭建荣，贾东林，喻 君，沈华春

(1.宁波大学医学院附属李惠利医院麻醉科，浙江宁波 315040;2.北京大学

第三医院麻醉科，北京 100083;3.皖南医学院附属弋矶山医院麻醉科，安徽芜湖 241001)

脓毒症时机体发生一系列的炎症反应和抗炎反应，释放大量细胞因子和炎症介质的同时，循环和组织内肾素－血管紧张素系统(renin-angiotensin system，RAS)高度激活，其在脓毒症的病理过程中发挥的作用尚未阐明。本研究通过血管紧张素Ⅱ1型受体(angiotensinⅡ 1 receptor，AT1R)拮抗剂氯沙坦(losartan，LOS)在内毒素(LPS)诱导的脓毒症大鼠的干预效果，探讨AT1R拮抗剂在脓毒症大鼠中的保护作用及可能机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组 清洁级♂SD大鼠30只，体质量200～220 g(由宁波大学实验动物中心提供)。大鼠腹腔注射戊巴比妥钠(30 mg·kg－1)后股动、静脉穿刺置管分别用于动脉测压和静脉给药。将大鼠随机分成对照组(Control组):生理盐水，iv，n=10;脓毒症组(LPS组):细菌内毒素(LPS，O127B8，Sigma 公司)12 mg·kg－1，iv，n=10;氯沙坦组(LOS组):氯沙坦(MSD 公司)50 mg·kg－1ip，30 min 后LPS 12 mg·kg－1iv，n=10。实验全程监测平均动脉压(MAP)、心率及呼吸的变化。脓毒症模型制作成功的标志是以注射LPS后大鼠MAP下降25%～30%并能维持该水平为标准。LPS注射6 h后采血待检，随即处死大鼠取出胸主动脉立即放入液氮速冻，然后转入－80℃备检。

1.2 检测指标及方法 注射LPS 6 h后各组大鼠心脏穿刺采血5～6 ml检测下述指标:①硝酸盐还原酶法测定血浆一氧化氮(nitric oxide，NO)浓度;②TBA法测定血浆丙二醛(MDA)浓度;③ 酶联免疫(ELISA)法测定细胞因子IL-1β及TNF-α的血浆浓度。④逆转录－聚合酶链反应(RT-PCR)法检测大鼠胸主动脉IκB mRNA的表达，各组PCR反应产物经凝胶电泳、图谱扫描后，采用Totalab图像分析软件对PCR电泳扫描图进行分析，以IκB mRNA的积分光密度值与β-actin mRNA的积分光密度值的比值表示 IκB mRNA的表达水平。⑤ Western blot法检测大鼠胸主动脉IκB蛋白的表达。胸主动脉匀浆裂解后依次进行蛋白定量、电泳分离、转膜、封闭，加入1∶500稀释的抗IκB单克隆抗体(SC-371，Santa Cruz公司)孵育，TBST洗膜，加入二抗孵育，TBST洗膜、ECL胶片曝光、显影、定影。将图片进行密度扫描，以IκB的积分光密度值与β-actin的积分光密度值的比值表示IκB蛋白的表达水平。

2 结果

2.1 各组大鼠血浆NO、MDA、IL-1β及TNF-α浓度的变化 与对照组比较，LPS组NO、MDA、IL-1β及TNF-α的血浆浓度均明显升高(P＜0.01)，而在LOS治疗组中，以上各指标均较LPS组明显回落(P＜0.01)，但仍较正常大鼠升高(P＜0.01)。见Tab 1。

Tab 1 Plasma concentrations of NO，MDA，IL-1β and TNF-α in each group(±s，n=10)

Tab 1 Plasma concentrations of NO，MDA，IL-1β and TNF-α in each group(±s，n=10)

＊＊P＜0.01 vs control;##P＜0.01 vs LPS

Group NO/μmol·L －1 MDA/μmol·L －1 IL-1β/μg·L－1 TNF-α/μg·L －1 Control 53.7 ±8.35.48 ±0.5 92.6±10.6 78.4±25.7 LPS 545±78.7＊＊ 19.2±3.6＊＊ 564.9±51.8＊＊ 724.8±75＊＊LOS 269.7 ±29.9＊＊## 10.8±1.1＊＊## 371.5±47.4＊＊##489.8±56.3＊＊##

2.2 各组大鼠胸主动脉IκB mRNA和蛋白的表达情况 与正常对照组比较，静脉注射LPS诱导而成的脓毒症大鼠胸主动脉IκB mRNA的表达(189±27)和蛋白的表达(77±12)均受到明显抑制(P＜0.01)，分别下降了31.5%和42.9%;而在 LOS治疗组中，大鼠胸主动脉 IκB mRNA的表达(233±25)较 LPS组升高了23.3%(P＜0.01)，IκB 蛋白的表达(103±13)较 LPS组升高了 33.8%(P＜0.01)，但治疗组IκB mRNA和蛋白的表达仍未恢复到正常水平，明显低于对照组(P＜0.01)，见Tab 2、Fig 1、2。

Tab 2 Expressions of IκB mRNA and protein in rat aortas of each group(±s，n=10)

Tab 2 Expressions of IκB mRNA and protein in rat aortas of each group(±s，n=10)

＊＊P＜0.01 vs control;##P＜0.01 vs LPS

B Pro Control 276±35 135±14 Group IκB mRNA Iκ LPS 189±27＊＊ 77±12＊＊LOS 233±25## 103±13##

Fig 1 Expressions of IκB mRNA in rat aortas of each group

Fig 2 Expressions of IκB protein in rat aortas of each group

3 讨论

脓毒症模型的制作有多种方法，我们采用静脉内一次性注射大剂量的LPS诱导脓毒症的模型，与直接给予细菌或盲肠结扎并穿孔等制作方法比较，模型稳定、便于脓毒症的严重阶段的实验研究，与我们以往报道基本一致［1］。炎症介质过度释放、炎症反应失控是脓毒症的中心环节，即使病因去除病程仍在进展，容易演变成脓毒性休克和多器官功能障碍，病情凶险，死亡率高［2］。因此如何干预或阻止脓毒症的恶化进程成为近来研究的热点。

肾素－血管紧张素系统(RAS)可独立存在于血管、心脏、肾脏等局部组织器官中，作为激素的血管紧张素Ⅱ(angiotensinⅡ，AngⅡ)被证实也是一种促炎因子，在脓毒症严重阶段机体RAS系统异常激活，AngⅡ在血浆和局部组织器官内急剧增高［3］，其生物学作用主要依赖AT1R介导，促使大量促炎细胞因子、活性氧族、脂质过氧化物等生成，严重损害组织细胞［4－5］。本研究检测出脓毒症大鼠血浆IL-1β和TNF-α等促炎细胞因子浓度明显升高，自由基NO及脂质过氧化物MDA的血浆浓度也比对照组明显升高，这与以往的报道基本一致［6－7］。当应用AT1R拮抗剂氯沙坦干预脓毒症大鼠后，发现IL-1β、TNF-α及NO、MDA等的血浆浓度均明显回落，可见过度激活的RAS受到抑制后，机体炎症反应得到一定的控制，同时NO释放减少，脂质过氧化程度也降低，从而控制或延缓脓毒症的病理进程。为进一步探讨AT1R拮抗剂对脓毒症大鼠的可能保护机制，本研究选用了NF-κB的主要抑制蛋白IκB进行评价。LPS作为病原相关分子模式(pathogen-associated molecular pattern，PAMP)与其模式识别受体(pattern recognition receptor，PRR)结合后通过多条信号转导途径介导 NF-κB 活化［8］，而 NF-κB 参与了炎症过程中多种信号转导途径，IL-1β、TNF-α等促炎细胞因子的生成大多受 NF-κB的调控［9］，并且NF-κB与促炎细胞因子形成一个循环放大的过程［10］，此外，LPS、NF-κB 及促炎细胞因子都能激活诱导型一氧化氮合酶(iNOS)，活化的iNOS刺激血管内皮细胞、平滑肌细胞、单核/巨噬细胞等大量合成释放NO从而加重脓毒症的病理反应［11］，因此干预NF-κB的活化成为研究的热点。在本实验中通过RT-PCR和Western blot方法发现感染性休克时大鼠胸主动脉IκB mRNA和蛋白的表达均明显下调，并且蛋白表达下降的幅度较mRNA更为明显，推测IκB蛋白表达低下除了与基因转录水平下调有关外，还与IκB蛋白部分被磷酸化转化成p-IκB相关，从而促使活性 IκB绝对数量低下，导致 NF-κB大量激活发挥系列生物学作用。当应用氯沙坦干预后，脓毒症大鼠IκB mRNA和蛋白的表达均明显升高。由此推测，异常激活RAS受到抑制后，表达上调的IκB在胞质中与NF-κB二聚体结合形成复合物，抑制NF-κB进入细胞核发挥转录激活作用，并且也可直接在细胞核内抑制NF-κB与DNA的结合，甚至还能够将NF-κB复合体从DNA上移开，与NF-κB 结合后使得 NF-κB/IκB 复合体从核内排出［12］，导致 NF-κB 的生物活性明显降低。

综上所述，AT1受体拮抗剂通过抑制过度激活的RAS系统，减轻促炎细胞因子、自由基NO和脂质过氧化物等对脓毒症大鼠产生明显的抗炎作用，该保护作用可能与其提高IκB表达继而降低NF-κB的活性相关。

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