高效液相荧光色谱法测定人血浆中坎地沙坦的质量浓度

叶朝清，于翠霞，杨晓红，朱余兵

(南京医科大学附属南京第一医院，江苏 南京 210006)

坎地沙坦由Astra公司和日本武田株式会社开发，1998年7月于瑞典首次上市，是一种选择性血管紧张素Ⅱ受体(AT)拮抗剂，可阻断AT1受体，松弛血管平滑肌，增加盐排泄，抑制细胞肥大(增生)，降低血压而不改变心率或心输出量，阻断血管神经收缩和醛固酮的分泌，从而起到降压作用[1－2]。坎地沙坦长期应用可逆转左室肥厚，降低左室重量指数，可治疗充血性心力衰竭[3]。本研究旨在建立一种快速、灵敏、专属性强、操作简便的高效液相荧光色谱(HPLC－FLU)法，以测定血浆中坎地沙坦浓度，并用于坎地沙坦的临床药代动力学研究。

1 仪器与试药

Agilent 1100型高效液相色谱仪(美国Agilent);超纯水仪(美国Millipore);电子天平(Mettler Toledo公司);低温离心机(上海科学仪器厂)。坎地沙坦标准品(中国药品生物制品检定所，纯度为98.9%，批号为100685－200803);空白人血浆，由南京市中心血站提供;甲醇(色谱纯，TEDIA公司，批号为1006908)，超纯水(自制)，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件与系统适用性试验

色谱柱:BaiAn－C18柱(150 mm ×4.6 mm，5 μm);流动相:甲醇 －0.02 mmol/L 磷酸盐缓冲液(pH=4.9，70∶30);流速:1 mL/min;柱温:30℃;检测波长:λex=265 nm，λem=395 nm。在此条件下，坎地沙坦保留时间为5.5 min，各目标化合物峰形良好，能有效分离，无杂峰干扰测定，基线平稳(见图1)。

2.2 溶液制备

图1 血浆中坎地沙坦高效液相色谱图

精密称取坎地沙坦标准品10.0 mg，置10 mL量瓶中，加入甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得1.0 g/L的坎地沙坦标准品储备液。精密吸取该贮备液1 mL，置10 mL量瓶中，加入甲醇稀释至刻度，摇匀，即得100 mg/L的坎地沙坦甲醇溶液;依次稀释，配成质量浓度为10 mg/L，1 mg/L，100 μg/L的坎地沙坦甲醇标准溶液。称取磷酸二氢钾2.72 g，溶于1000 mL超纯水中，加磷酸1 mL，摇匀，用三乙胺调pH为4.9，即得磷酸盐缓冲液(磷酸二氢钾浓度为20 mmol/L)，置4℃冰箱中冷藏备用。

2.3 血样配制

取离心管数支，分别精密加入不同量的坎地沙坦标准溶液后，以氮气流吹干，加入空白血浆0.5 mL，涡旋1 min，配成分别含坎地沙坦 0，2，5，10，20，50，100，300 μg/L 的标准含药血样，同法依次配成血浆中分别含坎地沙坦5，20，250 μg/L的低、中、高质控血样。

2.4 血浆样品处理

精密加入血浆样品0.5 mL，置离心管中，加入高氯酸(20%)沉淀液 100 μL，涡旋 1 min，于 16000 r/min离心 5 min。吸取上清液，置自动进样分析小瓶中，精密吸取20 μL进样分析。

2.5 方法学考察

线性关系考察:将系列浓度标准含药血样，按2.4项下方法操作，每种质量浓度做5份样品，记录色谱图及坎地沙坦峰面积。以坎地沙坦峰面积的平均值(As)对血药浓度(C)作回归计算，得回归方程 As=0.1277 C －0.0419，r=0.9984(n=5)。结果表明，坎地沙坦血浆质量浓度在2～300 μg/L范围内与峰面积线性关系良好，定量下限质量浓度为2 μg/L。

回收率及精密度试验:取离心管数支，于离心管中精密加入不同质量浓度的坎地沙坦标准溶液适量，以氮气流吹干后，加入0.5 mL超纯水，涡旋1 min，配成质量浓度分别为5，20，250 ng/mL的坎地沙坦溶液，精密加入20%高氯酸沉淀液100 μL，16000 r/min离心5 min，精密吸取上清液30 μL进样分析，记录色谱图和峰面积(Ax)。另取离心管数支，精密加入不同质量浓度的坎地沙坦标准溶液适量，以氮气流吹干后，精密加入0.5 mL空白血浆，涡旋1 min，配成含坎地沙坦5，20，250 ng/mL的含药血浆，每种浓度各做5份样品，按2.4项下操作。记录色谱图和峰面积(As)，上述 Ax和 As的比值即为坎地沙坦的绝对回收率，将 As代入相应标准曲线方程，计算测得质量浓度和加入质量浓度的比值即为相对回收率，同法可算出批内、批间精密度 RSD。结果见表1。

表1 回收率与精密度试验结果(n=5，)

表1 回收率与精密度试验结果(n=5，)

回收率(%) 精密度 RSD(%)加入质量浓度(μg/L)520250绝对85.8 ± 6.984.1 ± 3.987.1 ± 3.2相对97.3 ± 6.390.5 ± 6.495.2 ± 1.0批内6.24.01.8批间7.05.62.4

稳定性试验:取低、中、高3种质量浓度质控血样各5份，1份配制好后立即进样分析;另外4份血样中，1份于室温放置4 h后提取操作，1份放置4 h并提取后再于4℃放置12 h，1份于冰箱中冷冻保存3周后取出化冻，1份在3周内反复冻融3次，然后测定。结果各质量浓度血样测定值的偏差均小于10%，表明样品在上述条件下稳定性良好，符合生物样品分析要求(表2)。

表2 稳定性试验结果(μg/L)

3 讨论

关于坎地沙坦的含量测定文献报道较多，文献[4]采用高效液相紫外检测法，由于血浆中药物含量较低，内源性物质干扰大，难以达到所需的检测灵敏度。文献[5－7]采用HPLC－FLU法，但样品处理为盐酸酸化血浆后，用有机溶剂提取，甲醇或流动相溶解残渣，取上清液进样分析。此类方法灵敏度虽得到很大提高，但操作过程繁杂，系统误差大，试验成本较高，同时有机溶剂对操作者毒害大。笔者采用外标法，血浆样品经100 μL 20%高氯酸沉淀后，取上清液20 μL进样分析，h该方法操作简单、快速、准确度高，避免了有机溶剂的毒性和复杂的操作过程。在对色谱条件进行优化的过程中，笔者比较了缓冲液中磷酸盐的不同浓度、有机相与水相的不同构成比及流动相的不同pH对分析结果的影响，选择甲醇－0.02 mmol/L 磷酸二氢钾缓冲液(70 ∶30，pH=4.9)作流动相，在此条件下，坎地沙坦峰形良好，无杂峰干扰测定，基线平稳，样品分析时间短(6.5 min)，适合大样本量的测试。该方法中，磷酸盐的浓度不宜很高，避免在使用时柱平衡和冲洗时间长，防止磷酸盐析出堵塞管路。试验结果表明，该方法样品处理简单、特异性强、灵敏度较高、重现性好，符合生物样品分析要求，可用于该药的生物样本中含量的测定和临床药代动力学研究。

[1]吕向群.抗高血压新药坎地沙坦研究进展[J].中国药业，2005，14(5):77－79.

[2]黄建耿，李 高，斯陆勤，等.高效液相色谱法测定人血浆中坎地沙坦的含量[J].中国药师，2005，8(4):293 －294.

[3]Erdmann E，George M，Voct B，et al.The safety and tolerability of candesartan cilexetil in CHF[J].J Renin Angiotensin Aldosterone Syst ，2000，1(11):31 －36.

[4]张永东，魏秀华，王安发，等.HPLC法测定坎地沙坦酯及其有关物质[J].中南药学，2004，2(2):80－83.

[5]朱余兵，邹建军，钱 薇，等.健康受试者口服复方坎地沙坦酯片后坎地沙坦的药代动力学研究[J].中国临床药理学与治疗学，2007，12(4):474－477.

[6]周玲洁，戴 维，顾丽华，等.高效液相色谱法测定中国健康志愿者血清中坎地沙坦及坎地沙坦西酯片的人体药动学[J].复旦学报，2008，35(4):552－555.

[7]金小平，韩 俊，刘亚妮.2种坎地沙坦酯制剂的人体生物等效性研究[J]. 中国药房，2007，18(11):841 －843.