高效液相色谱法测定艾司唑仑片中艾司唑仑含量

杨惠霞，何文斌

(1.广东省佛山市中医院药剂科，广东 佛山 528000; 2.广东省佛山市药品检验所，广东 佛山 528000)

艾司唑仑(estazolam)又称舒乐安定，临床主要用于失眠，也可用于焦虑、紧张、恐惧，还可用于抗癫痫和抗惊厥[1]。本品常规剂量小(1 mg/片或2 mg/片)，在测定过程中受辅料、仪器、溶剂等因素的影响较大，易造成结果偏差[2]。2005年版《中国药典(二部)》[3]对艾司唑仑片含量测定采用紫外分光光度法，该法的测定过程需要使用两种仪器，过程烦琐，而高效液相色谱法选择性高，灵敏、准确。笔者尝试使用反相高效液相色谱法测定艾司唑仑片的含量，现报道如下。

1 仪器和试药

Agilent1100 series型液相色谱系统，包括四元泵G1311、柱温箱G1316A、检测器G1314A;ER－182A型电子分析天平;KQ－300型超声清洗器(昆山市超声仪器有限公司，功率为300 W，工作效率为40 kHz)。艾司唑仑对照品(中国药品生物制品检定所，批号为1219－0102);艾司唑仑片(江苏济川制药有限公司，批号为070201，070320，070605，规格为 1 mg);甲醇为一级色谱醇，水为超纯水，其他试剂均为分析纯。

2 方法和结果

2.1 色谱条件

色谱柱:Kcromaisil ODS－1－C18柱(200 mm ×4.6 mm，5 μm);流动相:甲醇－水(60∶40);流速1.0 mL/min;检测波长 223 nm;柱温30℃;进样量20 μL。理论板数按艾司唑仑计算均大于5000。

2.2 溶液制备

取艾司唑仑对照品适量，精密称定，加流动相制成每1 mL含艾司唑仑0.2 mg的对照品贮备液;精密吸取5 mL对照品贮备液，置50 mL量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，经0.45 μL微孔滤膜滤过，即得对照品溶液。精密称取艾司唑仑细粉(约相当于艾司唑仑1 mg)，置50 mL量瓶中，加流动相溶解并稀释到刻度，摇匀，经0.45 μL微孔滤膜滤过，即得供试品溶液。取不含艾司唑仑的空白制剂样品，按照供试品溶液制备方法制备，即得阴性对照品溶液。

2.3 方法学考察

系统适用性试验:分别吸取对照品溶液、供试品溶液、阴性对照品溶液20 μL，注入高效液相色谱仪，记录色谱图。结果阴性对照品溶液在艾司唑仑出峰位置无干扰，色谱图见图1。

图1 高效液相色谱图

线性关系考察:分别精密吸取对照品溶液 5，10，20，20，50，100 μL，注入液相色谱仪中，按上述色谱条件测定，峰面积分别为824.2，1650.2，3315.6，4984.8，8334.2，16759.7。以峰面积为纵坐标、艾司唑仑进样量 (μg)为横坐标绘制标准曲线。计算得回归方程 Y=8145.5 X－34.453(r=1.0000)，线性范围为 0.103 ～2.06μg。

精密度试验:精密吸取对照品溶液20 μL，注入高效液相色谱仪，连续进样6次。结果的 RSD为0.13%(n=6)，表明仪器精密度良好。

稳定性试验:精密吸取同一供试品溶液20 μL，注入高效液相色谱仪，在 0，2，4，6，8，24 h 时测定。结果峰面积的 RSD 为 0.45%(n=6)，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

重复性试验:精密称取同一批样品细粉6份，依法制备供试品溶液并测定。结果艾司唑仑含量为平均标示量的95.23%，RSD为1.3%(n=6)，表明方法重复性良好。

加样回收试验:精密称取同一批样品细粉(相当于艾司唑仑约1 mg)6份，置100 mL量瓶中，加30 mL流动相溶解，精密加入对照品贮备液5 mL，加流动相稀释到刻度，摇匀，经过0.45 μL微孔滤膜滤过，取续滤液分别进样，按外标法以峰面积计算艾司唑仑的含量并计算回收率。结果见表1。

表1 艾司唑仑加样回收试验结果(n=6)

2.4 样品含量测定

取3批样品，依法制备供试品溶液，按拟订的色谱条件测定，以峰面积按外标法计算百分标示量，并与2005年版《中国药典(二部)》[3]的紫外分光光度法进行比较。结果见表2。

表2 样品含量测定结果(%，n=3)

3 讨论

高效液相色谱法的方法学考察，RSD要求小于2%，平均回收率在98% ～102%[4]。而本法的方法学考察结果均符合要求，说明方法可行。

在流动相的选择时，根据文献[5－8]，曾经试用过乙腈－水(60∶40)和甲醇－乙腈－水(40∶20∶40)，结果色谱图均有辅料峰出现;而在甲醇－水(60∶40)流动相中，不仅片剂辅料对主峰无干扰，且主峰出峰时间符合规定。试验过程中，还比较了甲醇∶水的比例分别为 70∶30，50∶50，60∶40 的分离效果，结果甲醇－水(70∶30)出峰时间为4 min左右，但与一小杂质峰分不开;甲醇－水(50∶50)出峰时间为15 min左右，出峰时间过长;甲醇－水(60∶40)为7 min左右，且分离完全。因此，选择甲醇－水(60∶40)作为流动相。

艾司唑仑在0.1 mol/L的盐酸溶液中最大吸收波长为268 nm，在乙醇及0.1 mol/L的氢氧化钠溶液中最大吸收波长在223 nm[9]，参考中国药典对艾司唑仑有关物质的检查，以223 nm为检测波长较佳。

本法测出的百分标示量比紫外分光光度法低。经分析验证，发现在268 nm波长下，片剂辅料有紫外吸收，故紫外分光光度法测得含量相对偏高，本法测得结果正常，这表明高效液相色谱法结果更准确。在操作方面，高效液相色谱法简便、快捷，进样量少，可控程度高，因而高效液相色谱法可作为艾司唑仑片中艾司唑仑的含量测定方法。

[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典临床用药须知(化学药和生物制品卷)[M].北京:化学工业出版社，2005∶11.

[2]熊建华，李金龙，毛未芹.不同过滤方法对艾司唑仑片含量及其均匀度测定的影响[J].海峡药学，2005，17(3)∶76.

[3]国家药典委员会.中华人民共和国药典(二部)[M]:北京∶化学工业出版社，2005∶300.

[4]刘文英.药物分析[M].第5版.北京∶人民卫生出版社，2003∶81.

[5]叶美娣，徐 颜，汪学梅.HPLC测定地西泮和艾司唑仑的血药浓度[J].中国现代应用药学，2000，17(1)∶60.

[6]唐细美，宋湘芝，陈学和.HPLC同时测定血清中4种苯二氮卓类药物浓度[J].广东药学，2001，11(6)∶39.

[7]张 丽，何 林，孙世明.HPLC法同时测定血清中舒乐安定和安定[J].中国药学杂志，2000，13(2)∶97.

[8]江 燕.高效液相色谱法检查艾司唑仑片及片剂中的有关物质[J].中国医院药学杂志，2004，24(10)∶651.

[9]刘晓哲.艾司唑仑片含量及含量均匀度测定方法探讨[J].齐鲁药事，2007，26(6)∶348.