高效液相色谱法同时检测血浆中阿莫西林和克拉维酸的血药浓度

林 晶

(北京市朝阳区妇儿医院，北京 100021)

阿莫西林克拉维酸钾是一种可供口服、肌肉注射、静脉注射的β－内酰胺类和β－内酰胺酶抑制剂抗生素，主要用于敏感菌引起的呼吸系统、泌尿系统、皮肤及软组织感染，现广泛应用并作为抗菌感染的一线治疗药物。笔者建立了快速、准确、同时测定阿莫西林和克拉维酸血药浓度的高效液相色谱(HPLC)法，现报道如下。

1 仪器与试药

高效液相色谱仪系统，包括Waters 510型泵(美国Waters公司)，Waters 490E型紫外检测器，WDL－95型大连色谱工作站，Sartorius电子天平(1/10万)。阿莫西林对照品(含量为86.2%，批号为 130409－200208)，克拉维酸对照品(含量为 95.0%，批号为130429－200203)，内标物为对乙酰氨基酚(批号为 100018－200408，含量为99.5%)，均由中国药品生物制品检定所提供;阿莫西林克拉维酸钾(4∶1)分散片(商品名博美欣片，每片156.25 mg，批号为20040406，东药集团沈阳施德药业有限公司);甲醇和乙腈(HPLC纯，美国Tedia公司);磷酸二氢钾、磷酸(AR);水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱:Phenomenex luna C18柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm); 柱温:室温;流动相:磷酸盐缓冲溶液(pH=3.0)－乙腈(95∶5，V/V);流速:1.2 mL/min;灵敏度:0.005 AUFs;紫外检测波长:230 nm;进样量 20 μL。

2.2 标准贮备液的配置

分别精密称取阿莫西林和克拉维酸对照品5.0 mg，用三重蒸馏水定容至10 mL容量瓶中，配制成0.5 g/L的标准溶液，分装于一次性带盖塑料杯中并做好标记，置－40℃冰箱中保存备用。精密称取内标5.0 mg，用三重蒸馏水定容至10 mL容量瓶中配制成0.5 g/L的溶液，再精密量取1 mL，用三重蒸馏水定容至10 mL量瓶中，配制成50μg/mL的内标溶液，置冰箱中保存备用。

2.3 血浆样品处理

取血浆0.2 mL，加入内标(对乙酰氨基酚质量浓度为50μg/mL)10 μL，再加入冷甲醇 0.4 mL，涡旋混匀 1 min，12000 r/min 转速离心5 min，取上清液20 μL进样。

2.4 方法学考察

专属性考察:取空白血浆、加药血浆、受试者血浆，依法进样，色谱图见图1。可见，克拉维酸、阿莫西林、内标与血浆内源峰分离良好，保留时间分别为 5，9，15 min。

图1 高效液相色谱图

标准曲线制备:取7支具塞离心管，第1管加入空白血浆0.4mL，其余管分别加入空白血浆0.2 mL，然后在第1管中加入10 μL阿莫西林和6 μL克拉维酸标准贮备液，混匀后用等倍稀释法再配成含阿莫西林 13.20，6.60，3.30，1.65，0.83，0.41，0.21μg/mL 和克拉维酸 8.60，4.30，2.15，1.07，0.54，0.27，0.13μg/mL 的血浆样品，按照2.3项下方法操作，测定色谱峰面积，以样品峰面积与内标峰面积的比值为 Y轴、质量浓度为 X轴进行回归。得标准曲线回归方程，阿莫西林 Y=0.1485 C+0.006714， r=0.9998(n=7)，线性范围为 0.21 ～13.20μg/mL;克拉维酸 Y=0.0778+0.0161，r=0.9994(n=7)，线性范围为 0.13 ～8.60μg/mL。最低定量限阿莫西林为 0.2μg/mL，克拉维酸为 0.1μg/mL。

回收率试验:以3种高、中、低质量浓度的阿莫西林克拉维酸血浆标准品进行回收试验，按照2.3项下操作，测定结果代入血浆标准曲线计算其质量浓度，以实测质量浓度与理论质量浓度之比求算回收率。结果见表1。

表1 阿莫西林克拉维酸回收率试验结果(n=5，D)

表1 阿莫西林克拉维酸回收率试验结果(n=5，D)

理论质量浓度(μg/mL) 实测质量浓度(μg/mL) 回收率(%)阿莫西林13.201.650.41克拉维酸8.601.070.27阿莫西林13.59 ± 0.621.70 ± 0.170.45 ± 0.05克拉维酸8.48 ±0.461.04 ±0.090.30 ±0.04阿莫西林102.94103.27110.73克拉维酸98.6597.57111.85

精密度试验:以3种高、中、低质量浓度的阿莫西林克拉维酸血浆样品，按照拟订的方法操作，测定峰面积比。3种质量浓度于1 d内分别连续测定5次，计算测得值的变异(RSD);每天配制高、中、低3种质量浓度样品各1份，连续5 d，每天测定1次，计算测得值的变异(RSD)。结果见表2。

表2 精密度试验结果(n=5，)

表2 精密度试验结果(n=5，)

组分 测得质量浓度(μg/mL) 精密度的 RSD(%)加入质量浓度(μg/mL)阿莫西林克拉维酸13.201.650.418.601.070.27日内13.40 ± 0.351.62 ± 0.050.48 ± 0.038.81 ± 0.291.09 ± 0.050.28 ± 0.02日间13.59 ± 0.621.72 ± 0.130.45 ± 0.058.47 ± 0.461.04 ± 0.090.30 ± 0.04日内2.582.896.173.314.378.11日间4.597.6512.075.478.6713.73

稳定性试验:由于克拉维酸血浆样品常温下不稳定，因此本试验除考察了其精密度外，还考察了其长期－40℃冰箱保存的稳定性。结果克拉维酸血浆样品在此条件下保存15 d稳定，待测血浆样品处理后测定，RSD均小于15%。

2.5 样品测定

1例健康男性志愿者，禁食12 h后，于早晨8:00空腹用200 mL室温的水送服博美欣片，剂量为625 mg。服药前1 h至服药后4 h内控制饮水，服药后4 h进标准餐。受试者在服药后避免剧烈活动。取血操作在临床监护室中进行。受试者肘静脉处埋入留置针，分别于服药前及服药后 0.25，0.50，1.00，1.50，2.00，2.50，3.00，4.00，5.00，6.00，7.00，8.00 h 抽取受试者静脉血 3 mL，肝素抗凝，立即离心，分离出血浆后，置－40℃冰箱保存待测。按照拟订方法操作，测定峰面积比，测定结果代入血浆标准曲线计算其质量浓度。结果见表3。

表3 阿莫西林克拉维酸样品测定结果(μg/mL)

3 讨论

关于阿莫西林和克拉维酸的含量测定，文献报道的有微生物法[1]和高效液相色谱法[2－4];检测的标本微生物法[2]采用血浆，高效液相色谱法除文献[2]采用血清，其余[3－4]均采用血浆，但采用高效液相色谱法的文献均使用衍生化提取样品。笔者所建立的高效液相色谱法，采用血浆直接提取操作。

本试验在文献[5]报道的方法基础上对流动相的比例等条件进行了改变，由于其报道中口服量较大(750 mg)，且克拉维酸含量较大(阿莫西林∶克拉维酸为2∶1)，故本试验使用了内标参照以减小误差;另外，由于克拉维酸稳定性较差，文献[2－4]采用柱前衍生化法，文献[6]采用4℃离心法，方法较烦琐，而本法采用冷甲醇沉淀，离心时间缩短，离心后用保温瓶冰浴保存，并当天内完成。本试验操作简单、结果准确，并可同时测定阿莫西林和克拉维酸的血药浓度。

根据初步试验结果可见，与国外报道阿莫西林克拉维酸(4∶1)用药1 h后达平均血药浓度峰值的时间相当。本法快速准确，比较适用于临床检测，可为阿莫西林和克拉维酸血药浓度生物等效性研究提供简便、易行、准确的方法。

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