球形红细菌生物转化槲寄生中总三萜类化合物的测定

侯晓峰 ，郑庆红 ，漆小梅 ，杨官娥 *，张肇铭

1.山西医科大学药学院，山西太原 030001；2.山西大学生命科学与技术学院，山西太原 030006

槲寄生为桑寄生科槲寄生属植物V.coloratum（Komar.）Nakai的干燥带叶茎枝，具有祛风湿、补肝肾、强筋骨、安胎作用[1]。其中含有黄酮类、生物碱类、三萜类、多肽等化合物。球形红细菌为光合细菌中的一种，为一种有益菌，可以转化中药中的部分成分[2-3]。本课题组通过一定工艺制得球形红细菌转化槲寄生培养液（PSBT），提高了槲寄生的抗肿瘤活性，降低了其毒性。通过系统分离、细胞毒活性筛选表明，三萜类化合物为其中细胞毒活性的有效部位之一[4]。本文建立槲寄生及球形红细菌转化槲寄生培养液中总三萜类化合物的含量测定方法，并对槲寄生及PSBT中各含量进行比较研究，为球形红细菌转化槲寄生化学成分和转化机制研究奠定基础。

1 仪器与试剂

1.1 药材

由亳州市中药饮片厂加工，东北产地，并经山西医科大学药学院中药学教研室高建平教授鉴定为桑寄生科槲寄生属植物槲寄生[V.coloratum（Kom.）Nakai]。药材标本保存于山西医科大学药学院中药学教研室。

1.2 培养基[5]

1.3 菌种

紫色非硫菌群红细菌属的球形红细菌（rhodobacter sphaeroides），由山西大学光合细菌研究室分离鉴定保藏，菌液含菌数 8.0×108个/ml。

1.4 主要仪器及试剂

UV 2802型紫外可见分光光度计（美国尤尼柯）；齐墩果酸对照品（中国药品生物制品检定所，批号：110709-200304），其他试剂均为分析纯。槲寄生各提取物及各转化液样品，见表1。

表1 槲寄生各提取物及各转化液样品表

2 方法与结果

2.1 固定化球形红细菌的制备

将已培养好的球形红细菌培养液在5000 r/min下离心30 min，菌体用生理盐水洗涤2次，收集湿菌体。将终浓度为10%（g/g）的聚乙烯醇（PVA）加水加热溶解，冷却到 35℃，加入终浓度为30%（g/g）的湿菌体，搅匀，注射器滴入pH值为6.5（用NaOH调节）的饱和硼酸水溶液中形成直径为3 mm左右的固定化球形红细菌细胞，将形成的小球放入4℃冰箱中固定化18 h，蒸馏水洗涤3次，培养液中活化24 h，待用[4]。

2.2 三萜类化合物的测定及对比研究[5-9]

2.2.1 对照品溶液的配制 精密称取齐墩果酸对照品20 mg，置于100 ml容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得浓度为0.2 mg/ml的齐墩果酸对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液的配制 取10 ml待测样品溶液，减压蒸干，加乙醚适量回流提取至提取液无色，挥干溶剂，加甲醇稀释至刻度，摇匀。因样品中总三萜含量相差很大，如果不在线性范围内，做适当稀释后测定。

2.2.3 最大吸收波长的确定 分别取经显色后的对照品及供试品溶液，在200～800 nm范围内扫描。结果表明，样品、对照品均在535 nm处有最大吸收，故选择535 nm作为测定波长。

2.2.4 专属性试验 取经显色后的常规光合细菌培养基（即阴性对照，按“1.2”项下方法配制），在 200～700 nm 范围内扫描。结果在535 nm处没有吸收，说明选择535 nm作为测定波长，阴性对照无干扰。

2.2.5 标准曲线及线性范围的考察 精密吸取上述对照品溶液 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 ml，分别置具塞的试管中，挥去溶剂，准确加入5%的香草醛-冰醋酸溶液和1.00 ml高氯酸，混匀，在60℃恒温水浴中加热15 min，冰水浴中冷却至室温，加入5.00 ml的冰乙酸，转移至10 ml量瓶中，加乙酸乙酯稀释至刻度，摇匀（浓度用C表示），在535 nm处测定吸光度（A）。线性方程为A=21.988C-0.072，相关系数r=0.9895，线性范围为 2～12 μg。

2.2.6 精密度试验 取对照品溶液0.4 ml，按“2.2.5”项下方法显色，连续测定5次，测得含量的RSD=1.13%，表明分析方法精密度良好。

2.2.7 重现性试验 取同一批样品5份，按“2.2.2”项下方法配制供试品溶液，按“2.2.5”项下方法测定，测得含量的RSD=3.12%，表明分析方法重现性良好。

2.2.8 稳定性试验 取经显色后的供试品溶液，在1 h内每隔10 min测吸光度1次，30 min内测得含量的RSD=3.65%，以后吸光度相差很大，故测定应该在显色后30 min内测定。

2.2.9 加样回收率试验 取已知总三萜含量的培养液5 ml，分别加入对照品溶液 3、5、7 ml。按“2.2.2”项下方法配制供试品溶液，按“2.2.5”项下方法测定，计算回收率。见表2。

表2 回收率测定结果（n=3）

2.2.10 样品含量测定及比较 取样品溶液分别制备供试品溶液，在535 nm处测定吸光度，如超出线性范围，稀释至适当倍数测定，表1中1～9号样品总三萜类含量 （n=3）分别为1.80、0.22、4.34、4.44、2.10、0.22、0.18、0.24、0.01 mg/ml。

3 讨论

本研究结果显示，槲寄生水提取液（样品2）及槲寄生水提取液的球形红细菌转化液（样品6、7、8），其总三萜含量都很低，说明水不能将槲寄生药材中的三萜类提取完全；75%的乙醇提取、半量常规培养基、游离球形红细菌细胞培养，所得培养液（样品3）总三萜含量和槲寄生75%的乙醇提取液（样品1）相比增加141%，说明经过球形红细菌转化可以增加槲寄生提取液中的总三萜的含量；样品4和样品3相比，总三萜含量稍有增加，说明固定化球形红细菌在一定条件下有利于样品中总三萜类化合物的转化，但球形红细菌固定化后不适合药用，需要进一步考虑；另外，样品4和样品5中总三萜含量相比增加111%，说明培养液中不添加常规培养基，适合固定化球形红细菌对槲寄生药材中三萜类化合物的转化，使总三萜的含量增加。由此可见，在不同的条件下，对各种类型化合物的最佳转化条件是不同的，也体现了中药全成分生物转化的复杂性。本文建立槲寄生及球形红细菌转化槲寄生培养液中总三萜类化合物的含量测定方法，并对槲寄生及PSBT中各含量进行比较研究。为球形红细菌转化槲寄生化学成分和转化机制研究奠定基础。

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