肝细胞癌中HBx蛋白与生存素蛋白表达的关系及其意义

陈 江，崔 彬，姜汉国

广东省廉江市人民医院肿瘤科，广东廉江 524400

乙型肝炎病毒感染影响到全球近4亿人口，是肝细胞癌（hepatic cellular cancer，HCC）最重要的独立危险因素。乙型肝炎病毒是3.4 kb的DNA病毒，含有4个部分双链的开放读码框，编码C、S和X蛋白及病毒DNA聚合酶，其中X蛋白（HBx）已明确和肿瘤发生有关。X蛋白是一种多功能蛋白，通过一种未知的机制使细胞分裂及死亡发生调节障碍，HBx缺乏转变活性，但可以使肝脏表达HBx的易感品系的转基因小鼠发生肝细胞癌[1-2]。生存素是一种新近发现的在人类大部分肿瘤组织中表达的一种抗凋亡蛋白，其主要作用是凋亡抑制及细胞周期调节。本试验通过免疫组织化学方法检测二者在HCC组织的表达，探讨其在HCC发生中的作用。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2000年2月～2010年5月我院外科手术切除的HCC标本58例，临床和病理资料完整。患者均未经过任何抗肿瘤治疗，其中，男46例，女12例；年龄23～86岁，中位年龄60岁；Edmondson病理分级：1～2级 16例，3级以上 42例。47例AFP增高，伴有门静脉癌栓18例，腹腔淋巴结及远处转移9例。所有组织标本均经10%甲醛固定，石腊包埋，5 μm连续切片。

1.2 方法与试剂

HBx蛋白抗体和人生存素（FL-142）单抗及S-P试剂盒均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。免疫组化采用S-P方法，操作步骤如下：石蜡切片脱蜡至水；3%H2O2室温孵育5～10 min；微波抗原修复；正常山羊血清封闭，室温15 min，滴加p53和生存素抗原工作液，冰箱内4℃过夜；PBS冲洗，滴加第二代生物素，标记二抗工作液，室温20 min；PBS冲洗，滴加第二代辣根酶标记链霉卵白素工作液，室温20 min；PBS冲洗，DAB显色，自来水冲洗，苏木素复染，封片。已知的肝癌HBx及生存素阳性切片为阳性对照，磷酸盐缓冲液（PBS）作为空白对照。

1.3 结果判断

观察每张切片至少有5个具有代表性的高倍视野，不少于1000个细胞，HBx和生存素均以胞质或胞核出现棕黄色颗粒为阳性染色，这样的细胞大于或等于100个为阳性，对免疫组化结果进行评估。HBx阳性表达定位于细胞核 （图1），生存素阳性表达定位于细胞质（图2），均呈棕黄色。

图1 HBx阳性表达（S-P×200）

图2 生存素阳性表达（S-P×200）

1.4 统计学方法

采用SPSS 13.0软件进行统计学分析，计数资料用百分率表示，采用χ2检验，相关分析采用spearman等级相关系数，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肝细胞癌组织中乙型肝炎病毒X蛋白及生存素的表达及关系

HBx的阳性表达信号多为核型，生存素的阳性表达定位于细胞质，均呈黄色颗粒。HBx的阳性率为46.6%（27/58），生存素的阳性率为69.0%（40/58），差异有统计学意义（χ2=5.365，P＜0.05）；HBx阳性的 HCC组织生存素的阳性率为 70.4%（19/27），HBx阴性的HCC组织生存素的阳性率为 27.5%（11/40），差异有统计学意义（χ2=8.673，P＜0.05）。 等级相关分析表明，HCC组织中HBx和生存素的表达呈正相关（r=0.413，P＜0.05）。 见表 1。

2.2 乙型肝炎病毒X蛋白及生存素表达与肝细胞癌临床病理参数的关系

HBx在HCC组织中的阳性表达率与Edmondson分级相关（r=0.4327，P＜0.05）；Ⅰ～Ⅱ级阳性率为 18.8%，≥Ⅲ级阳性率为57.1%。有门静脉癌栓者的阳性率（66.7%）明显高于无门静脉癌栓者（37.5%），差异有统计学意义（P＜0.05）；AFP 增高者HBx的阳性率明显高于正常者，差异有统计学意义（P＜0.05）；HBx 的表达与有无转移无关（r=0.2354，P＞0.05）。生存素在病理分级差、有门脉癌栓及转移和伴有AFP高的HCC组织中的阳性表达率明显高于病理分级好、无门脉癌栓及转移和不伴有AFP高的HCC组织的阳性表达率。见表1。

表1 肝细胞癌组织中乙型肝炎病毒X蛋白及生存素的表达及关系[n（%）]

3 讨论

嗜肝病毒科的来源于哺乳动物的正嗜肝DNA病毒具有表达X蛋白的功能，X蛋白的结构与宿主细胞DNA糖基化酶功能结构域具有同源相似特点，而DNA糖基化酶是DNA复制时碱基切除修复的主要酶[3]。在乙型肝炎病毒诱发的肝细胞癌的过程中X基因经常与肝细胞DNA整合，HBX促进细胞周期进程，使抑制细胞生长的调节因子失活，与p53及其他肿瘤抑制因子及衰老相关因子结合并抑制其功能。近年研究表明，HBX调节转甲基酶转录，使DNA局部甲基化导致抑癌基因沉默或者使DNA全部甲基化造成染色体不稳定，从而在肝癌发生中起作用。抗凋亡作用与p53抑制有关，促进凋亡作用机制不明。HBX能够增加端粒酶逆转录酶的表达及端粒酶的活性从而延长肝细胞寿命有利于恶变，羟基末端去除的HBX失去了抑制细胞增殖及促进凋亡性能，增强了其调控癌基因的功能，使胰岛素样生长因子调节异常，促进增殖及凋亡抑制，使细胞生长失控[4]。

生存素是人类基因组中的肿瘤特异性基因，正常的成人组织罕有表达，在大部分人类肿瘤中高表达。生存素含有特征性的锌指结构称为BIR结构域，属于凋亡抑制蛋白（IPA）家族成员之一，其他凋亡抑制蛋白家族成员的凋亡抑制是直接与细胞内半胱天冬酶结合抑制其活性，生存素不能直接与半胱天冬酶结合，乙肝病毒X蛋白相互作用蛋白（HBXIP）作为辅助因子在生存素引发的凋亡抑制起一定作用[5]。HBX蛋白的C末端与HBXIP结合再与生存素结合形成复合物，该复合物可以与前半胱天冬酶-9结合，从而阻止其募集到凋亡前酶活化因子（Apaf-1）上，使生存素借助细胞色素C介导的凋亡途径选择性地抑制半胱天冬酶的蛋白酶活性，在细胞凋亡中发挥桥梁作用[6]。

本研究显示，HBX上调生存素的表达，提示肝细胞癌发生凋亡抑制。另外，HBx蛋白可与p53蛋白结合并使其失活，而生存素基因是一个被野生型p53基因抑制的基因[7]，HBx蛋白上调生存素在肝细胞癌中的表达形成凋亡抵抗，本研究结果证明了这一点。病理分级分化差，伴有门脉癌栓及AFP增高有转移者HBx及生存素表达上调，表明HBx及生存素表达与肝细胞癌的恶性程度疾病进展有关。HBx上调生存素表达使细胞周期调控失常，凋亡障碍增殖过度，可能是乙型肝炎病毒感染引起肝细胞癌原因之一。

[1]Wen Y,Golubkov VS,Strongin AY,et al.Interaction of hepatitis B viral oncoprotein with cellular target HBXIP dysregulates centrosome dynamics and mitotic spindle formation[J].J Biol Chem,2008,283(5):2793-2803.

[2]陈江,吴晓燕.HBV感染对原发性肝细胞癌生物学行为及Survivin表达的影响[J].海南医学院学报,2006,12(6):517-518.

[3]Van Hemert FJ,Van De Klundert MA,Lukashov VV,et al.Protein x of hepatitis B virus:origin and structure similarity with the central domain of DNA glycosylase[J].PLoS One,2011,6(8):233-242.

[4]Kew MC.Hepatitis B virus x protein in the pathogenesis of hepatitis B virus-induced hepatocellular carcinoma [J].J Gastroenterol Hepatol,2011,26(Suppl 1):144-152.

[5]Marusawa H,Matsuzawa S,Welsh K,et al.HBXIP functions as a cofactor of survivin in apoptosis suppression[J].EMBO J,2003,22(11):2729-2740.

[6]张晓东,马宏涛,叶丽虹,等.HBXIP基因对乙肝病毒X蛋白诱导细胞凋亡的影响[J].中国生物化学与分子生物学报,2005,21(3):403-407.

[7]Wolann K,Pwocka K.Role of survivin in mitosis[J].Postepy Biochem,2007,53(1):10-18.