慢病毒载体介导人非小细胞肺癌A549细胞Akt2基因靶向抑制

刘 丹 黄 燚 陈勃江 蒲 蓉 曾 静 王 蕾 李为民

肺癌是一种严重威胁人类健康的恶性肿瘤，其中，约80% ～85%是非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)。尽管肺癌治疗已取得显著的进步，但患者5年生存率仍无明显改善［1］。因此探索肺癌发病机制，寻求新的治疗靶点已成为当前的一项重要任务。

Akt信号通路作为潜在的肿瘤治疗靶点，是目前肿瘤治疗领域的研究热点。Akt是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，作为信号通路的重要枢纽，它通过调节下游靶分子活性，参与多种细胞生物学功能，促进肿瘤的发生发展及血管的发生［2-3］。Akt共有三种亚型，包括Akt1、Akt2、Akt3。其中，Akt2是Akt的重要亚型，在许多肿瘤中都发现Akt2的基因扩增、蛋白有过度表达，然而Akt2在NSCLC中的作用尚存在争议，其介导的特异性信号通路也未阐述清楚，相关研究报道较少［4-5］。本研究旨在采用慢病毒shRNA表达载体介导的RNA干扰技术，在NSCLC细胞株中靶向抑制Akt2基因表达，获得稳定干扰Akt2表达的NSCLC细胞株，为进一步探讨Akt2在肺癌中的作用机制奠定研究基础。

材料与方法

一、实验材料

1.细胞株、菌株及病毒载体:人肺腺癌细胞株(A549)，293T细胞及大肠杆菌菌株DH5α均为本实验室培养，慢病毒载体系统购自上海吉凯基因公司。

2.主要试剂:DMEM、胎牛血清、胰蛋白酶及双抗购自美国Hyclone公司，质粒抽提试剂盒购自美国Qiagen公司，Age I及EcoRI内切酶购自美国New England Biolabs公司，蛋白提取试剂盒购自南京凯基生物公司，Akt2抗体购自美国Cell Signaling Technology公司，BCA蛋白定量试剂盒购自美国Pierce公司。

二、实验方法

1.细胞培养:A549及293T细胞以10%胎牛血清的DMEM培养基，100 U/ml青霉素和100 μg/ml链霉素，在37℃、5%CO2、饱和湿度细胞培养箱中进行培养。贴壁生长的细胞2～3 d更换培养液一次，观察细胞贴壁铺满培养皿70%～80%时可进行传代。

2.制备特异性沉默Akt2的重组质粒(pGCsil-shAkt2-GFP载体的构建):根据RNA干扰设计序列原则及既往文献报道，采用Invitrogen公司BLOCK-iT在线设计并进行评估测定(表1)，选择最佳动力学参数靶点于上海吉凯基因公司合成含干扰序列的dsDNA oligo(表2)。把合成的引物干粉溶解于退火缓冲液中，经Age I和EcoRI酶切pGCsil-GFP载体，以使其线性化。载体和dsDNA Oligo连接，于16℃连接过夜，干扰序列插入pGCsil-GFP质粒，经感受态细胞5DHα转化、阳性克隆测序鉴定所插入的片段。PCR反应体系:Primer(+):5’-CCTATTTCCCATGATTCCTTCATA-3’;Primer(-):5’-GTAATACGGTTATCCACGCG-3’，pGCsil空载:306bp，阳性克隆:343bp。抽提重组质粒及辅助包装元件载体质粒pHelper 1.0和p-Helper 2.0，通过阳离子脂质体lipofectemin2000介导细胞转染及慢病毒包装，收集浓缩病毒，分装、-80℃保存。

表1 Akt2 siRNA干扰序列设计信息Table 1 Information of Akt2 siRNA interference sequence

表2 干扰序列dsDNA oligo设计信息Table 2 Information of dsDNA oligo interference sequence

3.病毒滴度测定(孔稀释法测定滴度):准备96孔板，以4×104细胞/孔密度铺板，体积为100 μl。37℃、5%CO2孵箱培养24 h，使细胞贴壁。准备7～10个无菌的EP管，倍比稀释病毒原液，并以第一个EP管中的10 μl病毒原液记为1E+1 μl，第二个EP管中为第一个EP管的1/10，记为 1E+0 μl，第三个:1E-1μl…… 第七个:1E-5 μl，第八个:1E-6 μl。吸取96 孔板中待检测细胞孔内的90 μl培养基，丢弃。依次加入90 μl稀释好的病毒溶液。将96孔板置入细胞孵箱培养24 h后，加入完全培养基100 μl，注意不要吹起细胞。继续放入细胞孵箱培养。4 d后，观察荧光表达情况，荧光细胞数随稀释倍数的增加而减少。根据公式:病毒滴度=感染荧光的细胞数/病毒原液量，计算病毒滴度。

4.shAkt2重组慢病毒感染靶细胞A549:将A549细胞按5×104/孔接种于6孔板中，37℃、5%CO2培养箱内培养至细胞融合度约达30%。根据预实验感染条件摸索，A549细胞的MOI值为50，感染条件为完全培养基+5 μg/ml polybrene。根据MOI值加入适量病毒及polybrene，在水平方向轻轻拍打培养板，使培养基和病毒等试剂充分混匀，然后放入孵箱培养孵育。培养24 h后更换为含10%胎牛血清的完全培养基。感染3 d后观察慢病毒报告基因GFP的表达情况。

5.筛选稳定表达shAkt2的细胞克隆:流式细胞分选具有分选精度高(99%以上)速度快的特点。成功感染shAkt2细胞同时表达报告基因GFP蛋白，以GFP为标记获得高纯度稳定转染shAkt2的细胞克隆。根据BD FACSCalibur流式仪操作要求进行分选，将表达GFP强阳性细胞群分选至无菌离心管中。离心管内的细胞悬液平分至培养皿中，37℃，5%CO2孵箱培养细胞。24 h后观察细胞生长状态及GFP表达情况。

6.荧光定量PCR检测细胞Akt2的表达:细胞共分3组:正常对照(A549)组，阴性对照病毒(NC)组，Akt2干扰(shAkt2)组。抽提三组细胞的总RNA，根据Promega公司M-MLV操作说明书进行，总RNA经70℃变性，0℃冰浴退火。经逆转录反应1 h，获得逆转录反应产物-cDNA，取部分用于PCR，余保存在-80℃下。PCR引物信息如下:

Akt2:

上游引物:5’-GCGGAAGGAAGTCATCATTG-3’

下游引物:5’-GTGGGTCTGGAAGGCATAC-3’

设定程序为两步法Real-Time PCR:经变性、退火、延伸过程，并对数据进行Real time分析，分析采用 2-ΔΔCt分析法进行。

7.Western blot检测Akt2的蛋白表达:根据凯基生物蛋白抽提试剂盒操作说明抽提细胞蛋白。并采用二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)法测定总蛋白含量，经SDS-PAGE凝胶电泳，80～100 V电泳1～2 h后，采用湿转方法转膜，用封闭液(含5%脱脂牛奶的TBST溶液)，室温、摇床上封闭PVDF膜2 h。4℃孵育过夜。第2天，TBST洗膜5 min×3次。室温孵育二抗(1︰1000)及内参GAPDH(1︰5000)1 h。Millipore公司 Luminata Crescendo Western HRP substrate显色液孵育3 min，Molecular Image ChemiDoc XRS System(Bio-Rad)曝光5 s～10 min。Quantity one分析软件测定条带灰度。

8.统计学分析:用SPSS 13.0统计软件进行分析，数据表示为，采用方差分析(analysis of variance，ANOVA)，最小显著差(least-significant difference，LSD)法两两比较。P＜0.05有统计学意义。

结 果

一、重组pGCsil-shAkt2-GFP质粒的鉴定

1.阳性克隆的PCR鉴定:pGCsil-shAkt2-GFP连接产物转化感受态大肠杆菌，经37℃过夜培养，挑选出的阳性克隆溶于LB培养基，作为菌落PCR模板。PCR凝胶电泳图如图1，以dd H2O(1泳道)为阴性对照，排除系统中外源核酸污染导致的假阳性结果，Maker指示PCR产物的片段大小(3泳道)，结果显示，阳性克隆组(4-7组)PCR产物条带大小约为343bp(从载体中切出24bp)，大于空载体自连对照组(2泳道)(片段大小约306bp)，说明阳性克隆已插入外源片段，需进一步测序验证。

图1 pGCsil-shAkt2-GFP质粒菌落PCR电泳图Figure 1 PCR electrophoretogram of pGCsil-shAkt2-GFP plasmid

2.重组质粒的测序:挑选重组质粒阳性克隆送至Invitrogen公司测序。测序报告见图2，结果显示:阳性克隆序列内含有干扰Akt2的shRNA片段序列，片段序列为:

CcggGCACAGGTTCTTCCTCAGCTTCAAGAGAGCTGAGGAAGAACCTGTGCTTTTTg，片段大小为57 bp，与之前所设计的针对Akt2的shRNA片段序列完全符合。证明shAkt2序列已成功克隆到慢病毒pGCsil-GFP载体中。

图2 重组pGCsil-shAkt2-GFP质粒测序鉴定Figure 2 Sequence of recombinant pGCsill-shAkt2-GFP plasmid

二、shAkt2慢病毒表达载体的滴度测定

逐孔稀释法测定病毒滴度，病毒原液经倍比稀释感染293T细胞，培养4 d后，观察细胞荧光表达情况。以病毒原液记为1E+1μl，递次稀释十倍，依次类推稀释病毒记为1E+0μl，1E-1μl，1E-2μl……1E-6μl。根据细胞荧光表达情况如图3所示，在加入1E-6μl病毒原液的孔中观察到3个带有荧光的细胞，则本实验获得重组Akt2-shRNA慢病毒滴度为:3/(1E-6)=3E+6 TU/μl，即3E+9 TU/ml，满足实验需要。

三、稳定干扰Akt2基因细胞克隆的筛选

1.重组慢病毒shAkt2感染A549细胞:将重组慢病毒shAkt2和NC对照病毒同时感染人肺腺癌细胞株A549，24 h后更换为完全培养基，观察细胞荧光表达情况。5 d后，A549细胞感染效率达80%以上，感染后细胞状态良好(图4)。

图3 重组shAkt2慢病毒滴度测定Figure 3 Lentivirus titer of recombinant shAkt2

图4 各组细胞病毒感染率及GFP荧光表达水平Figure 4 Virus infection，and GFP expression in cells

2.流式分选筛选稳定干扰Akt2的细胞克隆:成功感染shAkt2细胞同时表达基因GFP蛋白，以GFP为标记，经流式细胞仪分选GFP强阳性细胞，占细胞总数的90.1%(图5)，获得稳定沉默Akt2基因的细胞克隆。

图5 流式细胞分选表达GFP强阳性的shAkt2细胞Figure 5 GFP Strong positive shAkz cells obtained by flow cytometer

四、Akt2基因干扰效果的验证

1.荧光定量PCR检测Akt2 mRNA的表达水平:抽提A549、NC及纯化后shAkt2细胞组细胞的总RNA，采用β-actin作为内参，2-ΔΔCt分析法分析Akt2 mRNA含量，方差统计分析结果示，阴性对照组与未感染病毒A549细胞mRNA水平无明显变化，而shAkt2细胞组与A549及NC组比较，Akt2 mRNA明显抑制(P=0.001和 P=0.002，图6)，与正常组相比，抑制率约为 63.39%，提示shAkt2细胞克隆显著干扰Akt2 mRNA的表达。

图6 各组细胞中Akt2 mRNA的表达水平Figure 6 Akt2 mRNA expression in A549，NC and shAkt2

2.Western blot检测Akt2的蛋白表达水平:未感染病毒A549细胞、NC阴性对照组和稳定转染shAkt2细胞组抽提总蛋白，以β-actin为内参，进行western blot检测，统计各组条带灰度值，比较Akt2蛋白在各组细胞中的表达水平。如图7所示，shAkt2细胞组中Akt2的蛋白表达较其他两组明显抑制(P＜0.01)，与正常对照组A549相比，蛋白表达量抑制率为91.56%，说明shAkt2组细胞Akt2蛋白表达获得稳定抑制。

图7 A549、NC及shAkt2组细胞Akt2蛋白表达水平的比较Figure 7 Comparison of Akt2 protein expression in A549，NC and shAkt2

讨 论

Akt2基因是Akt家族的重要亚型，负责编码丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，定位于人类染色体的19q13.1-q13.2。已证实Akt2作为癌基因参与了多种肿瘤的发生和发展，并介导肿瘤细胞生长、黏附、运动、侵袭和转移。本研究拟通过制备有效的靶向干扰Akt2基因的重组慢病毒载体，感染肺腺癌细胞株A549，并检测其对A549细胞的Akt2基因的沉默效率，建立稳定干扰Akt2基因的细胞克隆，为后续研究Akt2在NSCLC中的作用奠定基础。

RNA干扰(RNA interference，RNAi)技术是由双链RNA(double-stranded RNA，dsRNA)诱导同源靶基因mRNA特异性降解，从而特异性抑制目的蛋白的表达，导致转录后基因沉默的现象［6］。由于其具有高度靶向性和高效性等特点，成为肿瘤研究领域的重要方法，广泛应用于基因功能、干细胞发育、信号转导及抗肿瘤治疗等多学科领域。

在细胞内，dsRNA分子被胞内RNA酶Dicer降解为大小约21～23个碱基的小片段RNA，即siRNA，随之，siRNA在RNA解旋酶的作用下解链成正义链和反义链，其中，反义siRNA与体内的内切酶、外切酶、解旋酶等结合形成 RNA诱导的沉默复合物(RNA-induced silencing complex，RISC)［7-8］。RISC具有核酸酶功能，能够与外源性基因表达的mRNA在同源区内进行特异性的结合，并在此结合部位切割降解mRNA，诱发宿主细胞产生针对这些mRNA的降解反应。同时，在RNA聚合酶作用下，以siRNA为引物与靶RNA结合从而合成大量的dsRNA，使RNAi作用进一步放大，最终促使靶mRNA完全降解［6，9-10］。RNAi具有高效、特异的靶向沉默基因的作用，目前已经成为基因治疗和基因功能研究的重要工具。

目前RNAi的制备方法主要包括化学合成、体外转录、体内表达。尽管化学合成的siRNA能特异性抑制细胞内同源基因的表达，但在细胞内容易降解，稳定性差，而将小发卡RNA(small hairpin RNA)导入细胞后，能在细胞内稳定转录生成shRNA，并进一步加工成靶基因特异性siRNA，从而发挥稳定、长期抑制靶基因的表达作用［11-12］。然而，一般的shRNA尽管能够转染到分裂细胞中，但是很难导入到非分裂细胞、原代细胞及人或动物体内去。因此，利用病毒载体包括慢病毒及腺病毒等，因其操作方便、转染效率高及稳定性表达等而被广泛应用。使用腺病毒载体感染细胞时，病毒DNA游离在细胞核内，不能整合到染色体上，在体内不能实现稳定长期表达，并且容易引起免疫反应［13-15］。慢病毒载体是以人类免疫缺陷型病毒(human immunodeficiency virus，HIV)为基础发展起来的基因治疗载体，既能够感染分裂细胞，而且可以感染非分裂细胞，尤其是携带shRNA的慢病毒载体，不仅能够广泛的感染宿主细胞，而且也能够稳定整合于靶细胞的基因组内，具有表达时间长、靶向性佳，不易诱发宿主免疫反应、安全性好等优点。因此，表达shRNA的慢病毒载体已广泛应用于多种细胞内基因功能的研究［16］。

本研究所使用的慢病毒载体系统由pGCsil-LV载体、p-Helper 1.0载体和p-Helper 2.0载体组成。pGC-LV载体中含有HIV的基本元件5’LTR和3’LTR以及其他辅助元件，例如WRE(woodchuck hepatitis virus posttranscriptional regulatory element)。根据不同的实验目的针对pGC-LV载体改造以进行启动子活性研究、基因表达研究、RNAi等研究。pHelper 1.0载体中含有HIV病毒的gag基因，编码病毒主要的结构蛋白;pol基因，编码病毒特异性的酶;rev基因，编码调节gag和pol基因表达的调节因子。pHelper 2.0载体中含有单纯疱疹病毒来源的VSV-G基因，提供病毒包装所需要的包膜蛋白。

本研究根据RNAi干扰原理，针对Akt2设计干扰序列，并合成其寡核苷酸，连接至已线性化的慢病毒pGCsil-LV载体U6启动子下游，在大肠杆菌H5α内同源重组，经过限制性内切酶酶切和测序，证实重组成功后，转入哺乳动物细胞，载体表达出shRNA，这种shRNA很快在细胞中加工成为21～23个碱基大小的dsRNA分子，随后启动RNAi过程。同时质粒携带GFP序列，用于判读转染效果并筛选出稳定转染细胞。经进一步采用荧光定量PCR及western-blot检测Akt2基因表达水平。结果显示，实验组Akt2 mRNA水平较对照组下降大于63.39%，而蛋白水平减少91.56%，说明本研究构建的慢病毒shRNA表达载体在A549细胞内能持续、特异、高效的抑制Akt2基因表达，为后续研究奠定了技术基础，也为肿瘤基因靶向沉默治疗带来了新希望。

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