潮间带产絮凝剂放线菌的筛选及其培养条件的优化

耿 强，冯胜科，张 超，刘其友

(1.中国石油大学(华东)化学化工学院，山东 青岛 266555；2.天津大学化工学院，天津 300073；3.中国石化石油化工科学研究院，北京 100083)

微生物絮凝剂是一类可以使液体中不易降解的固体悬浮颗粒、菌体细胞及胶体等凝集、沉淀的特殊高分子代谢产物，是高效、廉价、安全、无毒、易降解、不产生二次污染的新型水处理剂[1]。

目前，产絮凝剂微生物的种类很多，主要集中在土壤中的细菌，专门研究潮间带产絮凝剂放线菌的报道较少。作者在此系统地对潮间带具有较好絮凝效果的放线菌进行筛选，得到了一株絮凝活性较高的菌株Y-3，优化了其培养条件并考察了其对含油废水的处理效果。

1 实验

1.1 菌种与培养基

菌种来源于青岛开发区唐岛湾潮间带底泥。

分离培养基：可溶性淀粉 20 g，NaCl 0.5 g，KNO31 g，K2HPO4·3H2O 0.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，FeSO4·7H2O 0.01 g，琼脂 20 g，KCrO40.1 g，海水1000 mL，pH值7.4～7.6。

筛选与发酵培养基：可溶性淀粉 20 g，NaCl 0.5 g，KNO31 g，K2HPO4·3H2O 0.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，FeSO4·7H2O 0.01 g，KCrO40.1 g，海水 1000 mL，pH值7.4～7.6。

保藏培养基：高氏斜面培养基。

1.2 方法

1.2.1 菌株的筛选及鉴定

对菌株进行初筛和复筛，确定絮凝效果较好的菌株。采用Nikon TS100型相差生物显微镜及成像系统对筛选菌株的形态、特征进行观察，并通过生理生化实验[2]进行初步鉴定。

1.2.2 培养基及培养条件的优化

采用单因素实验，分别考察培养基组成及初始pH值、培养温度、摇床转速对絮凝效果的影响。

在单因素实验基础上，确定培养基以乙醇作为碳源、酵母膏作为氮源，选取4个主要因素即初始pH值、培养温度、乙醇用量、摇床转速作为放线菌发酵产絮凝剂的影响因素进行正交实验[3]，正交实验的因素与水平见表1。

表1 正交实验的因素与水平

1.2.3 含油废水絮凝实验

在500 mL烧杯中加入300 mL含油废水，用移液枪移取少量微生物絮凝剂，将烧杯置于电子变速搅拌机搅拌棒下，先快速(200 r·min-1)搅拌2 min，再慢速(60 r·min-1)搅拌6 min，然后静置10 min。之后从烧杯同一高度取50 mL上清液，测定含油废水的浊度、石油类和COD去除率。其中COD、浊度、石油类的测定分别采用重铬酸钾法、分光光度法和紫外分光光度法[4]。

1.2.4 絮凝率测定方法

采用高岭土法[5]测定絮凝效果，并加以修正。向250 mL烧杯中加入150 mL 4 g·L-1高岭土悬浮液、3 mL微生物絮凝剂产生菌的培养液，放置在六联搅拌机下，插入搅拌叶轮。先快速(200 r·min-1)搅拌1 min，再慢速(60 r·min-1)搅拌3 min，然后静置5 min。取上清液，用721型分光光度计测定其OD550。同时以蒸馏水代替培养液作对照实验。絮凝率按下式计算：

式中：A为对照上清液吸光度值；B为样品上清液吸光度值。

2 结果与讨论

2.1 菌株筛选与鉴定

2.1.1 菌株的分离与初筛

用高氏一号培养基对唐岛湾潮间带3处底泥样进行分离，结果显示高氏一号培养基上没有或很少菌落形成，说明高氏培养基缺乏海水中的某些微量元素，不适合潮间带底泥中放线菌的生长。将去离子水改换为海水后共分离出18株放线菌，所测絮凝率如表2所示。菌株絮凝效果分布见图1。

表2 初筛絮凝活性测定值/%

图1 放线菌絮凝效果分布图

由表2和图1可知，大部分放线菌具有一定絮凝活性，同时出现了絮凝率为负值的菌株，可能是由于放线菌自身在培养基中的代谢物质的影响。对高岭土具有较高絮凝活性(絮凝率>80%)的放线菌菌株共有3株，占16.67%，对其进行含油废水复筛实验。

2.1.2 菌株的复筛

对初筛得到的3#、4#、10#菌株进行含油废水的絮凝实验，结果如表3所示。

表3 复筛菌株对含油污水的絮凝效果/%

由表3可知，3#菌株不仅对高岭土具有很高的絮凝活性，对含油废水絮凝效果也最好，将其命名为Y-3，进一步进行优化培养。

2.1.3 菌株的鉴定

对复筛得到的Y-3菌株进行显微镜菌落特征检测，结果见图2。

图2 Y-3菌株的个体与菌落形态

由图2可知，菌株个体为细杆状，无鞭毛，菌落呈圆形，气生菌丝为乳白色，基质菌丝为象牙黄，表面粗糙有褶皱呈绒毛状，边缘整齐，中间突起。生理生化实验结果表明，菌株能利用蔗糖、葡萄糖但不能利用果糖，能使淀粉水解而不能使纤维素水解，能使牛奶凝固、明胶液化，这些特征基本符合放线菌链霉菌属[6]。因此，初步鉴定菌株Y-3为链霉菌属。

2.2 单因素实验结果

2.2.1 培养基组成对絮凝效果的影响(表4)

表4 培养基组成的优化/%

由表4可知，乙醇为碳源、酵母膏为氮源，放线菌产絮凝剂的絮凝效果较好。乙醇作为碳源，价格低廉并且具有灭菌作用，因此有利于工业应用。酵母膏为天然有机质，富含氮源以外的营养物质，利于代谢产物形成，产生的絮体较大。高盐度的培养基会降低放线菌的数量，抑制放线菌的生长[7]。因此，培养基宜选择低盐度。

2.2.2 培养基初始pH值对絮凝效果的影响(图3)

图3 初始pH值对絮凝效果的影响

由图3可知，在酸性条件下，pH值对絮凝效果的影响不大；当培养基偏中性(pH=6.0～7.5)时，絮凝效果最好；而在碱性条件下，絮凝率迅速下降，说明该放线菌所产絮凝剂为阴离子型[4]。

2.2.3 培养温度对絮凝效果的影响(图4)

图4 培养温度对放线菌发酵产絮凝剂的影响

2.2.4 摇床转速对絮凝效果的影响(图5)

图5 摇床转速对絮凝效果的影响

由图5可知，当摇床转速为140 r·min-1时，菌株Y-3所产絮凝剂的絮凝效果最好。

2.3 正交实验结果与分析(表5)

表5 放线菌产絮凝剂培养条件优化正交实验结果与分析

由表5可知，各因素对絮凝效果的影响大小依次为：培养温度>初始pH值>乙醇用量>摇床转速，培养温度对放线菌产絮凝剂的絮凝率影响最大。

综合考虑，确定最优培养条件为A2B2C3D1，即培养温度30 ℃、初始pH值7.0、乙醇用量35 mL·(L海水)-1、摇床转速130 r·min-1，在此条件下，放线菌Y-3对高岭土的絮凝率达到92.76%。

2.4 絮凝剂对含油废水的絮凝效果

考察在最优培养条件下放线菌Y-3所产絮凝剂对含油废水的处理效果。结果表明，浊度去除率为66.4%，COD去除率为19.23%，石油类去除率为23.64%，效果较好。

3 结论

(1)从潮间带底泥中筛选得到絮凝活性较高的菌株Y-3，优化的培养条件为：乙醇为碳源，酵母膏为氮源，低盐度；培养温度30 ℃，初始pH值7.0，乙醇用量35 mL·(L海水)-1，摇床转速130 r·min-1。在此条件下，对高岭土的絮凝率达到92.76%。

(2)放线菌Y-3对含油废水具有较好的絮凝效果和一定的降解作用，在最优培养条件下，所产絮凝剂对含油废水的浊度去除率达到66.4%、COD去除率达到19.23%、石油类去除率达到23.64%，具有一定工业应用价值。

[1] 徐美娟，胡惠仁，刘秋娟.环境友好絮凝剂——微生物絮凝剂[J].上海造纸，2004，35(1)：52-55.

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[6] 中国科学院微生物研究所放线菌分类组.链霉菌鉴定手册[M].北京：科学出版社，1975：13-15.

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