放线菌612243产除草活性代谢产物的研究

宗志友，周 瑜，徐文平，陶黎明

(1.上海师范大学生命与环境科学学院，上海 200234；2.华东理工大学药学院，上海 200237)

近年来，生物农药因其具有能克服化学农药对生态环境的污染和减少在农副产品中的农药残留量等优势，在病虫害综合防治中的作用愈来愈重要，地位也愈来愈凸显，其中微生物农药是生物农药最重要的组成部分。

微生物农药主要包括活体微生物农药和农用抗生素两大部分[1]。农用抗生素是在医用抗生素的应用基础上发展起来的，最早人们尝试用医用土霉素、链霉素防治某些果树、蔬菜上的病害，收到意想不到的效果，由此引发了农用抗生素的研究，距今不过几十年的历史。日本的农用抗生素研究发展最快，居于世界领先地位，先后开发出了春日霉素、灭瘟素、多氧霉素、有效霉素、灭孢素等[3]。世界上许多国家如美、日、意、俄、丹麦、印度等已将农用抗生素的研究列入国家发展的重点规划中。近年来，我国也将生物农药列入国家重点发展规划，取得了很大的成绩，生物农药的生产企业也达到一定的规模[4]。

作者在农用抗生素筛选的过程中，发现一株放线菌产生的次级代谢产物具有良好的除草活性，为此对这株微生物产生的代谢产物进行了发酵和分离提取纯化，获得了一个除草活性化合物。在此报道了该化合物的结构解析和生物活性研究。

1 实验

1.1 材料、培养基和仪器

供试菌株612243，由上海南方农药研究中心分离纯化自贵州高原地区的土样；除草剂筛选靶标均由上海南方农药研究中心提供。

种子培养基(g·L-1)：葡萄糖5，淀粉5，蛋白胨1，牛肉膏1，酵母膏1，琼脂粉15，pH值自然。

液体发酵培养基(g·L-1)：花生粉25，葡萄糖20，淀粉10，酵母膏4，氯化钠1，牛肉膏1，磷酸氢二钾0.005，pH值7.0～7.2。

Agilent1200MS-LC型液质联机色谱仪；东芝UV-2501PC型紫外全光谱扫描仪；Bruker Avance 500 MHz型核磁共振仪；气相色谱/质谱联用仪(英国质谱公司Micromass GCTTM)；液相色谱/质谱联用仪(英国质谱公司Micromass LCTTM)等。

1.2 活性产物的分离纯化

将培养好的斜面种子接种于已消毒的发酵培养基中，在28 ℃下振荡培养96 h，得到发酵液30 L。将发酵液于5000 r·min-1离心20 min，将沉淀部分用10 L 80%丙酮浸泡过夜。冷冻离心去除沉淀，将上清液减压旋转浓缩去除丙酮，然后与发酵液合并。用2 BV的正丁醇萃取3次，合并正丁醇相浓缩得到油状物，再用甲醇溶解，过滤去除甲醇不溶物，浓缩去除甲醇，得黄褐色油状物25 g。经硅胶柱层析分离(以二氯甲烷∶甲醇为40∶1至1∶5的流动相进行梯度洗脱)，根据生物活性跟踪结果，将活性部分浓缩，得淡黄色粉末状固体1.1 g。用少量甲醇溶解，进行TLC制备(以甲醇∶二氯甲烷=1∶40为展开剂)，将Rf值为0.35的具有除草活性的条带刮下，用无水甲醇浸泡2 h，过滤，滤液减压浓缩至10 mL左右，再用制备型HPLC进一步分离纯化(制备柱型号：VP250/21 Nucleosil 100-7 C18，612243-B流动相为甲醇∶水=75∶25，流速16 mL·min-1，检测波长210 nm)。收集活性单峰，浓缩，得白色粉末状纯品612243-B 25.8 mg，纯度为96%，对纯品进行结构鉴定。整个分离纯化过程以除草活性为生物活性跟踪。

1.3 生物活性测定

除草活性初筛采用黄瓜、苋菜、油菜、马唐、小麦和稗草的种子萌发抑制实验。复筛采用鲤肠、苋菜、小藜、马唐、狗尾和稗草的盆栽测定。

1.4 结构鉴定

将HPLC制备的活性组分612243-B溶解于0.5 mL CDCl3中，分别进行核磁共振扫描。记录1HNMR、13CNMR、DEPT90、DEPT135、COSY、NOESY、HMQC和HMBC等谱图信息。

2 结果与讨论

2.1 化合物612243-B结构的确定

根据612243-B电喷雾质谱图(ESI)，可知612243-B[M+K+]=616、[M+Na+]=600、[M+H+]=578，计算出该物质的分子量M=577。根据氮元素规则，分子中应该含有奇数个氮原子。该化合物的相关核磁数据见表1和表2。

表1 化合物612243-B的δC及其HMQC相关的δH

表2 化合物612243-B的1H-1H COSY和13C-1H HMBC信息/ppm

由表1、表2的数据可以确定化合物612243-B具有1个含4个双键的17个C的长链，1位C上有1个多位取代的吡啶基团，10位C上有1个葡萄糖基团，具体结构见图1。

图1 化合物612243-B的结构式

查阅文献[4，5]，确认化合物612243-B为葡糖基杀粉蝶菌素(Glucopiericidin A)，分子式为C31H47NO9。

2.2 化合物612243-B生物活性分析

由于葡糖基杀粉蝶菌素是已知的杀虫活性物质，未见文献报道其除草活性，为此进行了化合物612243-B的除草活性研究。离体除草活性生测采用杯碟法。具体生物活性见表3～表5。

表3 化合物612243-B的除草活性

表4 化合物612243-B茎叶处理鲜重防效结果

表5 化合物612243-B土壤处理结果

2.3 讨论

经文献查阅，未发现Glucopiericidin A具有除草活性的报道。用化合物Glucopiericidin A对不同植物进行茎叶处理时，该药剂最佳起效时间为3 d左右，以后药物可能被分解，植株主要表现为发黄、矮化、生长较弱，且受浓度影响。化合物612243-B施药20 d后，未死植株长势慢慢恢复，比CK小，说明施药后抑制其生长速度，会使杂草在与正常非靶标植物竞争中失去优势，营养被作物夺取，达到施药目的。施药20 d的鲜重结果发现，612243-B土壤处理靶标均无效果，而观察茎叶处理后的靶标发现，612243-B对双子叶靶标的药效要优于禾本科靶标。可以得出土壤处理的防效远低于茎叶处理的防效。这一结果可能与土壤吸附性或药剂传导性有关。

3 结论

在微生物农药的筛选过程中，发现编号为612243的放线菌株可产生除草活性物质。根据除草活性跟踪的结果，将其发酵产物进行溶剂萃取、层析及高效液相色谱制备等一系列的分离纯化处理，获得一个活性化合物612243-B。质谱分析表明，该化合物分子量为577、分子式为C31H47NO9；经其它光谱分析并对照数据库，确定该化合物与已知的葡糖基杀粉蝶菌素(Glucopiericidin A)相同，但未见文献报道其除草活性的研究。

[1] 陈轶林，张承来.微生物源活性物质的开发与化学新农药的创制[J].广东农业科学，2005，(3)：102-104.

[2] 李勇，杨慧敏.微生物农药的研究和应用进展[J].贵州农药科学，2003，31(2)：62-63.

[3] 朱昌雄，宋渊.我国农用抗生素的现状与发展趋势探讨[J].中国农业科技导报，2006，8(6)：17-19.

[4] Matsumoto M，Mogi Kin-ichi，Nagaoka Katsuhiko，et al. New piericidin glucosides，glucopiericidins A and B[J].The Journal of Antibiotics，1987，40(2)：149-156.

[5] Funayama Shinji, Ishibashi Masami, Anraku Yumi, et al.Novel cytocidal antibiotics，glucopiericidins A1 and A2. Taxonomy，fermentation，isolation，structure elucidation and biological characteristics[J].The Journal of Antibiotics，1989，42(12)：1734-1740.