甜菜碱的电喷雾质谱研究

王佳钰 ，张婷婷 ，许庆轩 ，孙 晖 ，周 芹 ，吴玉梅

（1.农业部甜菜品质监督检验测试中心，哈尔滨150080；2黑龙江中医药大学药学院，哈尔滨150040）

甜菜碱在甜菜糖蜜中首先发现并因此得名。它是一种高效甲基供体，能调节体内渗透压、促进脂肪代谢和蛋白质合成。由于对动物生长有多种作用[1－2]，因此主要应用于饲料。另外，甜菜碱具有多种药理作用[3－4]，在医药行业也有广阔的前景。甜菜碱的检测主要有分光光度法[5－6]和高效液相色谱法[7－8]。但是分光光度法定性能力较差，甜菜碱的紫外吸收波长较小（在192nm处最大吸收），容易受杂质及溶剂干扰。高效液相色谱法对前处理要求较高，工作费时费力。电喷雾质谱技术不需要复杂的前处理，在生物及天然产物分析中有着广泛的应用[9-12]，生物碱一般具有碱性和高质子亲核势，在电喷雾质谱中容易电离，因此具有很好的灵敏度和重现性，串联质谱给出化合物的结构信息，大大提高了定性能力[13-16]。

甜菜碱又称三甲基甘氨酸，系一种季胺型生物碱，分子中含有一个羧基和一个氨基，因此甜菜碱具有很高的质子亲核势，适合在正离子模式下检测。本文采用简单的前处理方法获得糖甜菜提取液，使用电喷雾质谱法很容易获得其正离子模式的质谱图，在其中选择与甜菜碱质核比相同的质谱峰碰撞诱导解离，将其与甜菜碱标准品的串联质谱进行对照，就可以很方便地鉴定出甜菜碱。本方法不需要复杂的前处理，具有很高的灵敏度和重现性，串联质谱给出的结构信息可以对甜菜碱定性，因此本方法可以作为复杂体系中甜菜碱的检测方法。

1 材料与方法

1.1 材料、仪器及试剂

实验材料：糖甜菜块根，栽培品种，由中国农科院甜菜研究所提供。

仪器设备：电喷雾质谱仪为ThermoFisher LCQ fleet（Thermo Fisher Scientific公司），氦气为缓冲气和碰撞气，使用电喷雾源，正离子模式。仪器条件优化如下：鞘气（sheath gas，氮气）流速：30arbitrary units；喷雾电压（ion spray voltage）：4.0kV；毛细管温度（capillary temperature）：180℃；毛细管电压（capillary voltage）：44V；套管透镜补偿电压（tube lens offset）：50V；注射泵（syringe pump）进样，进样速度为 5μL/min；碰撞能量 25%。

主要试剂为甲醇（色谱级，迪马公司），去离子水（Milli-Q纯水机制备），甜菜碱标准品购于SIGMA公司，甲酸、氨水均为分析纯。

1.2 实验方法

1.2.1 甜菜碱的电喷雾质谱研究 a）甜菜碱电喷雾质谱分析条件的研究：将甜菜碱标准品分别溶解于甲醇/水（50∶50），甲醇/水/甲酸（50∶50∶0.5），甲醇/水/氨（50∶50∶0.5）中制成 0.0001%的甜菜碱溶液，将此溶液用于电喷雾质谱检测，注射泵流速5μL/min。b）甜菜碱电喷雾串联质谱研究：根据1.2.1中a）实验选择合适的甜菜碱电喷雾检测条件，用于串联质谱研究，优化能量，使串联质谱处于最佳状态。

1.2.2 糖甜菜中甜菜碱的检测 取糖甜菜鲜样使用锯糊机制成糊状，取10g甜菜糊分别用30mL水提取2次，合并提取液过滤，加入60mL甲醇搅拌，静止1h，过滤，加入甲酸配成0.5%甲酸溶液，直接用于电喷雾质谱分析，并选择与甜菜碱相同质核比的峰进行串联质谱研究。

2 结果与讨论

甜菜碱在电喷雾负离子模式下没有信号，但是在正离子模式下信号很强。图1展示了甜菜碱在中性、碱性、酸性溶液的正离子电喷雾质谱。通常生物碱的质子亲核势较高，在电喷雾条件下容易形成质子化分子。图 1a 中，我们可以看出，在中性条件下，甜菜碱极易出现[M+H]+（m/z118）峰、[M+Na]+（m/z140）峰和[M+K]+（m/z156）峰，同时也会产生聚合现象，其聚合物也以加H、Na、K峰的形式出现。从总的趋势来看，这些峰的强度呈现正态分布，也就是随着聚合度的增加其强度也增加，在四聚体的情况下达到最强，之后随聚合度增加峰的强度呈现出逐渐降低的趋势。说明甜菜碱在中性条件容易聚合，四聚体处于空间结构最稳定状态，在这个区间聚合物只要表现为电荷吸引作用，空间排斥效应较小，之后随着聚合度的增加空间排斥效应逐渐变大，其稳定性逐渐降低，因此峰强度逐渐减弱。另外，甜菜碱加H、Na、K峰的强度表现为加H峰>加Na峰>加K峰，说明甜菜碱及其聚合物容易和半径小的离子结合。但是在四聚体的情况下加Na峰最强，说明钠离子半径适当，在四聚的情况下空间位阻最小。在通常情况下，碱性条件能够抑制正离子，因此不利于电喷雾正离子的形成。如图1b所示在碱性条件下，加Na及加K离子受到严重抑制，但是加H峰仍然很强，说明甜菜碱的质子亲核势很强，碱性条件对电喷雾质谱加氢离子抑制有限。在碱性条件下甜菜碱也存在聚合现象，但是这种聚合能力与中性条件下相比大大降低，并且聚合度越高稳定性也越差，峰的强度也随之降低。同样在酸性条件下，也只出现了[M+H]+峰（如图1c所示），这是由于氢离子的含量增多，竞争甜菜碱的能力大大高于钠、钾离子导致的。在碱性条件下氢氧根离子与甜菜碱共同竞争阳离子从而导致加甜菜碱加Na及加K离子消失，这就是在酸性和碱性条件下甜菜碱离子化的差别。另外，在酸性条件下，甜菜碱聚合物的强度很小，说明酸性条件严重影响甜菜碱的聚合。甜菜碱是两性化合物，含有酸碱两个活性集团，在中性条件下含有正、负电荷的两个活性位点，在酸性或碱性条件下只存在一个活性位点，在酸、碱条件下甜菜碱聚合能力降低，说明甜菜碱分子之间的聚合是由两个活性位点的正、负电荷相互吸引导致的。另外，这种聚合物的稳定性与甜菜碱的聚合度以及加和离子的大小也有很大关系（如图1a所示），说明空间效应对聚合有很大影响，也证明了这种聚合是非线型的，环型聚合的可能性最大。

选择甜菜碱的加氢离子（m/z118）做串联质谱，谱图如图2所示，在二级串联质谱中，m/z118的母离子丢失60、59Da的中性碎片，分别产生m/z58、59的子离子，甜菜碱的两个子离子的质量奇偶不同，这是甜菜碱在电喷雾串联质谱中典型特征。说明一个子离子含有氮原子，另一个子离子则不含氮原子，并且含氮原子的子离子峰比较强，也就可以推出羧基和氮原子之间碳氮键容易断裂，其碎裂机理如图3所示。

图4为糖甜菜水提取液的电喷雾质谱图，尽管没有经过复杂的前处理，提取液所含成分很多，但是m/z118峰仍然比较明显，对m/z118离子做串联质谱，所得谱图与图2相同 （图略），因此可以证明该峰就是甜菜碱的质谱峰。

3 结论

甜菜碱在水溶液中容易聚合，但是酸碱可以通过减少其电荷位点抑制其聚合。在电喷雾质谱中甜菜碱不仅能和质子加和，还能够和钠离子和钾离子结合。在我们的研究中甜菜中多种化合物与甜菜碱一样能够和金属离子结合，这可以解释甜菜能够耐盐碱胁迫机制。在酸性条件下，甜菜碱的电喷雾质谱图比较简单，容易解析，为最佳检测条件。甜菜碱的质子亲核势高，适合电喷雾质谱检测，甜菜提取液不需复杂的前处理就可以检测出甜菜碱，其特征的碎裂方式为该化合物的定性提供坚实的依据，用电喷雾质谱法检测甜菜碱具有灵敏度高、特异性强，操作简单，快速等优点，可以作为复杂体系中甜菜碱快速检测的绝佳方法。

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