中度嗜盐菌HS1产纤维素酶发酵条件的研究

韩秋菊，张倩倩

(辽宁石油化工大学，辽宁 抚顺 113001)

纤维素酶能使不溶性纤维素材料水解成简单糖，进而发酵产生乙醇，广泛用于农业、食品、酿酒、纺织、再生能源以及环境治理等领域[1～4]。中度嗜盐菌分布极其广泛，在盐碱环境(盐湖、海洋等盐水环境，盐碱地、盐池等盐土环境，盐渍发酵食品等人工环境)中能够存在[5]。其产生的纤维素酶也同样具有在盐碱环境中发挥作用的特性。研究发现，中度嗜盐菌具有很多潜在的工业应用价值。首先其易于在高盐环境中生长繁殖，因而能够最大程度地减少发酵过程中其它菌类的污染；同时营养要求比较简单，可以利用多种有机物作为碳源和氮源；中度嗜盐菌产生的酶在不同的盐度和温度下都能保持良好的活性，能满足工业操作单元中特殊的物理和化学条件[6]。

作者在此利用中度嗜盐菌HS1发酵产生纤维素酶，并对发酵条件进行了优化。由中度嗜盐菌产生的纤维素酶在盐碱环境中依然能保持活性，很大程度上拓宽了纤维素酶的应用范围，对于解决目前纤维素酶生产存在的稳定性差、产量低、成本高等问题有着重要的指导意义。

1 实验

1.1 菌株

中度嗜盐菌HS1，辽宁石油化工大学生物工程教研室保存。

1.2 培养基

嗜盐菌培养基：酪蛋白水解物5%，酵母粉0.5%，MgSO4·7H2O 0.2%，NCl 10%，K2HPO41%。

发酵培养基：酪蛋白水解物0.075%，酵母提取物0.1%，柠檬酸钠0.3%，MgSO4·7H2O 2%，KCl 0.2%，FeSO40.005%，NaCl 10%，麸皮5%。

1.3 方法

首先进行单因素实验，分别研究氮源、液体种子接种量、培养温度、初始pH值、培养时间等因素对菌株HS1产纤维素酶的影响；再基于单因素实验结果，设计4因素3水平的正交实验，对发酵条件进行优化。正交实验的因素和水平见表1。

表1 正交实验的因素与水平

1.4 纤维素酶活力测定

1.4.1 葡萄糖标准曲线的绘制[7]

取1 mL葡萄糖标准溶液，加入3 mL DNS试剂于25 mL比色管中混匀，置于沸水浴中5 min，冷却至室温，定容至25 mL，摇匀，在520 nm波长处测定吸光值。以葡萄糖浓度(mg·mL-1)为横坐标、吸光度为纵坐标绘制标准曲线，结果如图1所示。拟合线性回归方程为y=1.2113x+0.0175，R2=0.9946。

图1 葡萄糖标准曲线

1.4.2 酶活力的定义

在30℃、pH值为6的条件下，1 h分解纤维素产生相当于1 μmol葡萄糖所需的酶量，定义为一个酶活力单位。酶活力(U，U·mL-1)依下式计算：

式中：W为方程中计算出的相应的葡萄糖的浓度，mg·mL-1；1000为将mg折合为μg；n为酶液稀释总倍数；0.5为反应时间，h；M为样品的分子量(葡萄糖为180)。

2 结果与讨论

2.1 氮源对中度嗜盐菌HS1产纤维素酶的影响

分别添加1%尿素、1% NaNO3、1%蛋白胨、1% NH4Cl和1% (NH4)2SO4作为菌株HS1液体发酵氮源，培养24 h后测定纤维素酶活力，结果见图2。

图2 氮源对中度嗜盐菌HS1产纤维素酶的影响

由图2可知，NaNO3作为氮源时，菌株HS1产纤维素酶活力最大。进一步考察NaNO3浓度对中度嗜盐菌HS1产纤维素酶的影响，结果见图3。

图3 NaNO3浓度对中度嗜盐菌HS1产纤维素酶的影响

由图3可知，NaNO3浓度为1.5%时，纤维素酶的酶活力最大，为(52.58±1.52) U·mL-1。

2.2 液体种子接种量对中度嗜盐菌HS1产纤维素酶的影响(图4)

图4 液体接种量对中度嗜盐菌HS1产纤维素酶的影响

由图4可知，液体种子接种量为8%时，纤维素酶的酶活力最大，为(43.54±8.13) U·mL-1。

2.3 初始pH值对中度嗜盐菌HS1产纤维素酶的影响(图5)

图5 初始pH值对中度嗜盐菌HS1产纤维素酶的影响

由图5可知，当初始pH值为6.5时，纤维素酶的酶活力最大，为(51.32±6.51) U·mL-1。

2.4 培养温度对中度嗜盐菌HS1产纤维素酶的影响(图6)

图6 培养温度对中度嗜盐菌HS1产纤维素酶的影响

由图6可知，培养温度在30～40℃范围内纤维素酶具有较高的活性，当培养温度为35℃时，纤维素酶的酶活力最大，为(53.20±2.88) U·mL-1。

2.5 培养时间对中度嗜盐菌HS1产纤维素酶的影响(图7)

图7 培养时间对中度嗜盐菌HS1产纤维素酶的影响

由图7可知，培养前期酶活力随着培养时间的延长而增加；培养时间为3 d左右时酶活力达到最大，为(46.28±3.01) U·mL-1。

2.6 中度嗜盐菌HS1产纤维素酶的正交实验[8](表2)

由表2可知，最佳实验组合为A2B1C2D3，即优化的发酵条件为：培养温度35℃、培养时间4 d、初始pH值6.5、液体种子接种量6%。

3 结论

对中度嗜盐菌HS1产纤维素酶进行了研究。单因素实验和正交实验结果表明，菌株HS1产纤维素酶的最佳氮源是1.5% NaNO3，优化的发酵条件为：液体种子接种量6%，培养温度35℃、初始pH值6.5、培养时间4 d。

表2 正交实验结果与分析

[1] 肖春玲，徐常新.微生物纤维素酶的应用研究[J].微生物学杂志，2002，22(2)：33-35.

[2] 冯定远，刘玉兰.酶制剂在饲料工业中的应用进展[J].广东饲料，1999，(4)：35-37.

[3] 李燕红，赵辅昆.纤维素酶的研究进展[J].生命科学，2005，17(5)：392-397.

[4] Bhat M K，Bhat S.Cellulose degrading enzymes and their potential industrial applications[J].Biotechnol Adv，1997，15(3-4)：583-620.

[5] Ventosa A，Nieto J J，Oren A.Biology of moderately halophilic aerobic bacteria[J].Microbiology and Molecular Biology Reviews，1998，62(2)：504-544.

[6] 赵百锁.中度嗜盐菌在生物技术中的应用[J].微生物学通报，2007，34(2)：359-362.

[7] 诸葛健，王正祥.工业微生物实验技术手册[M].北京：中国轻工业出版社，1994：211-212.

[8] 栾军.现代实验设计优先方法[M].上海：上海交通大学出版社，1995：128-196.