PI3K/Akt信号转导通路与卵巢癌顺铂耐药相关性的研究

张 栋 孔德璇 和珍珍 瞿全新

磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）通路是一个经典的抗凋亡、促存活的信号转导途径，在肿瘤发生、增殖、侵袭、转移及放化疗抵抗中发挥重要作用。PI3K/Akt通路异常与卵巢癌的发生、发展有关，PI3K抑制剂联合传统化学疗法可能是一种有效抑制肿瘤生长和腹水产生的方法[1]。肿瘤细胞对顺铂（DDP）的获得性和先天性的耐药是DDP类化疗药抗肿瘤的一个最大障碍[2]。本研究利用LY294002抑制PI3K/Akt通路，探讨PI3K/Akt通路在卵巢癌DDP耐药中的作用。

1 材料与方法

1.1 材料 （1）细胞系：人卵巢浆液性乳头状囊腺癌细胞顺铂敏感株SKOV3，由天津医科大学免疫学实验室提供；人卵巢癌浆液性乳头状囊腺癌细胞DDP耐药株SKOV3/DDP，购自北京市肿瘤医院药物研究所。（2）仪器与试剂：一抗（PI3K兔抗人单克隆抗体、Akt兔抗人单克隆抗体）购自长沙嘉美生物公司；一抗（β-actin兔多克隆抗体）购自美国Santa Cruz公司；二抗（HRP-标记山羊抗兔IgG）购自北京中杉金桥生物技术有限公司，LY294002购自Promega公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养及分组 S KOV3、SKOV3/DDP细胞于37℃、5%CO2、含10%小牛血清的RPMI 1640培养基中培养。LY294002作用前后SKOV3、SKOV3/DDP细胞DDP半数抑制浓度值（IC50）实验分组。（1）LY294002作用组：将2种细胞分别置于LY294002浓度为40 μmol/L的培养基中，调节细胞浓度为1.0×105/mL，加入96孔板中，每孔180 μL培养4 h后取出，弃掉培养基，每孔加入含10%小牛血清的RPMI 1640培养基180 μL。配制各浓度DDP，每孔加入20 μL DDP，使DDP终质量浓度分别为 1 00.00、50.00、25.00、12.50、6.25、3.13、1.56及0.78 mg/L，每一浓度设4个平行孔。同时设立对照孔（只含等体积细胞悬液，不加药物）、空白调零孔（只含等体积完全培养基，不加药物）培养72 h。（2）LY294002作用前组：调节2种细胞浓度为1.0×105/mL，加入96孔板中，每孔180 μL，培养4 h后取出，加入各浓度DDP，方法同上，培养72 h。

检测细胞PI3K/Akt蛋白表达实验分组。（1）LY294002各浓度组：25 cm2细胞培养瓶培养2种细胞，待细胞生长至70%~80%汇合时，加入LY294002，配制成浓度为5、10、20及40 μmol/L，培养4 h后加入DDP，使DDP在SKOV3细胞中的终质量浓度为3.5 mg/L，在SKOV3/DDP细胞中的终质量浓度均为14.0 mg/L，分别接近其IC50。（2）DDP组：取DDP终质量浓度为SKOV3细胞3.5 mg/L、SKOV3/DDP细胞14.0 mg/L。（3）对照组：正常培养条件下的SKOV3和SKOV3/DDP细胞。以上细胞经处理后均培养24 h。

1.2.2 MTT法检测LY294002作用后SKOV3和SKOV3/DDP对DDP敏感性的影响 9 6孔细胞板每孔加入20 μL MTT溶液（5 g/L），培养箱中孵育4 h，弃掉培养基，每孔加100 μL二甲基亚砜（DMSO）振荡5 min，用酶标仪在570 nm处测定吸光度值（A）。计算各组细胞的抑制率。实验重复3遍，取平均值。细胞生长抑制率=（1-加药组A值/对照组A值）×100%。根据各组DDP浓度和抑制率，计算两者的回归系数a、b，代入公式：Y=a+blnX，计算细胞DDP IC50值。耐药倍数=（SKOV3/DDP细胞DDP IC50值）（/SKOV3细胞DDP IC50值）。

1.2.3 Western blot检测SKOV3和SKOV3/DDP细胞PI3K、Akt及β-actin表达 每 瓶细胞使用400 μL含苯甲基磺酰氟（PMSF）的RIPA裂解缓冲液提取细胞总蛋白。蛋白上样量为20 μL ，进行电泳、转膜、封闭后，1∶500比例加入一抗，孵育、洗膜，以1∶5 000加入二抗后孵育、洗膜、显影。胶片经Bio-Rad成像分析软件Quantity One分析结果，将目的蛋白与相应内参蛋白（β-actin）条带灰度值之比作为目的蛋白相对浓度。实验重复3次，取平均值。

1.3 统计学方法 采 用SPSS 10.0软件进行分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组间均数比较采用方差分析，两两比较采用LSD-t法，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 LY294002作用前后SKOV3、SKOV3/DDP细胞对DDP的敏感性 LY294002作用前后各浓度DDP对SKOV3、SKOV3/DDP细胞生长抑制率，见表1。LY294002作用前：SKOV3细胞DDP的IC50（3.309 4±0.177 1）mg/L；SKOV3/DDP 细 胞 DDP 的 IC50为（13.630 7±0.934 2）mg/L，耐 药 倍 数 为 4.12。LY294002作用后：SKOV3细胞DDP IC50为（1.080 2±0.062 1）mg/L，与LY294002作用前相比DDP IC50差异有统计学意义（t=20.57，P<0.001），SKOV3细胞经LY294002作用后对DDP敏感性增加了67.36%；SKOV3/DDP细胞DDP的IC50为（3.194 9±0.194 1）mg/L，与LY294002作用前相比差异有统计学意义（t=18.94，P<0.001），SKOV3/DDP细胞经LY294002作用后对DDP敏感性增加了76.56%。

表1 LY294002作用前后各浓度DDP对细胞生长的抑制作用 （%，±s）

表1 LY294002作用前后各浓度DDP对细胞生长的抑制作用 （%，±s）

0.78 1.56 3.13 6.25 12.50 25.00 50.00 100.00 7.71±1.05 35.66±3.49 49.64±1.25 81.10±1.85 89.78±1.28 91.19±1.02 91.93±0.92 94.04±2.36 28.17±2.80 57.47±2.06 68.67±2.80 92.40±0.89 95.71±0.99 97.00±0.87 96.70±0.76 97.55±0.37 4.59±1.17 9.05±0.53 13.04±1.38 19.49±1.38 43.33±2.34 71.51±2.40 86.72±2.72 89.63±1.29 20.06±1.74 28.86±4.11 39.97±1.07 70.46±4.12 87.46±1.25 90.37±0.71 93.79±1.27 95.45±1.19 SKOV3细胞抑制率作用前 作用后 作用前 作用后SKOV3/DDP细胞抑制率DDP（mg/L）

2.2 LY294002、DDP对SKOV3细胞中PI3K、Akt表达的影响 PI3K蛋白在LY294002各浓度组的表达量不同，且进一步组间两两比较差异均有统计学意义（均P<0.001)；Akt蛋白在LY294002各浓度组的表达量不同，差异有统计学意义（P<0.001)，进一步组间比较LY294002 5＋DDP组与DDP组间差异无统计学意义（P=0.488)，其他组间比较差异均有统计学意义（组间比较①∶②、①∶⑥、②∶⑤、⑤∶⑥P分别为0.038、0.006、0.011、0.019，其余组间比较均P<0.001），见表2。

2.3 LY294002、DDP对SKOV3/DDP细胞中 PI3K、Akt表达的影响 LY294002各组间PI3K蛋白的表达量不同，两两比较差异均有统计学意义（①∶②、⑤∶⑥P分别为0.005、0.004，其余组间比较均P<0.001）；各组间Akt蛋白表达两两比较差异均有统计学意义（均P<0.001），见表3。

2.4 SKOV3和SKOV3/DDP细胞中PI3K和Akt表达 SKOV3细胞对照组PI3K和Akt蛋白相对浓度值均低于SKOV3/DDP细胞对照组，差异均有统计学意义（t分别为26.005和23.477，均P<0.05），见表2、3。

表2 SKOV3细胞中PI3K及Akt表达水平 （ ±s）

表2 SKOV3细胞中PI3K及Akt表达水平 （ ±s）

**P<0.01；表3同

Akt 1.211 4±0.026 6 1.139 5±0.034 7 0.898 7±0.063 2 0.592 2±0.025 3 1.233 3±0.025 0 1.303 5±0.046 9 150.510**PI3K 0.715 6±0.030 2 0.626 9±0.017 1 0.510 0±0.018 0 0.366 3±0.005 2 0.796 6±0.003 9 0.879 7±0.034 8 276.341**组别LY294002 5+DDP①LY294002 10+DDP②LY294002 20+DDP③LY294002 40+DDP④DDP⑤对照组⑥F

表3 SKOV3/DDP细胞中PI3K及Akt表达水平（±s）

表3 SKOV3/DDP细胞中PI3K及Akt表达水平（±s）

组别LY294002 5+DDP①LY294002 10+DDP②LY294002 20+DDP③LY294002 40+DDP④DDP组⑤对照组⑥F PI3K 1.313 1±0.012 5 1.226 2±0.010 9 1.046 4±0.019 0 0.808 8±0.029 4 1.553 5±0.058 4 1.446 9±0.014 7 236.437**Akt 1.735 7±0.013 4 1.579 7±0.018 5 1.372 7±0.039 5 1.030 0±0.009 5 2.143 2±0.002 9 1.974 3±0.015 8 1217.000**

3 讨论

PI3K/Akt信号转导通路可能通过以下几种途径在卵巢癌的发生发展中起重要作用。（1）基因异常。PI3K CA的扩增、突变，PI3K CA基因编码PI3K的P110 α亚基，位于染色体3q26，人类许多恶性肿瘤组织中可见到该染色区域的异常扩增，PI3K CA基因扩增与卵巢癌发生有关。Levine等[3]对198例晚期卵巢上皮癌组织中编码P13K CA高度保守区域的EXON9和EXON20进行基因测序，发现其中24例（12%）发生突变。在原发性卵巢癌中，PI3K调节亚单位p85α编码基因的突变，导致ser608位点自动调节区域临近位点与SH2之间的序列丢失，PI3K处于持续活化状态，引起肿瘤发生。研究证实在一些卵巢癌组织中，Akt2基因发生扩增和过表达与肿瘤发生有关，并预示着预后不良[4]。（2）Akt表达异常。Noske等[5]发现58%原发性卵巢癌中存在Akt过表达，且与卵巢癌的临床分期及淋巴结转移相关，运用RNA干扰降低Akt表达能够抑制卵巢癌细胞增殖。

卵巢癌的耐药机制目前还不完全清楚，研究表明，Akt能够通过磷酸化其下游的多种作用底物促进肿瘤细胞的生长、增殖；抑制细胞凋亡；提高细胞的缺氧耐受；促进血管生成；促进肿瘤细胞侵袭、转移；促进对化疗和放疗的抵抗[1]。Zhang等[6]发现下调Akt表达可辅助抗肿瘤治疗。Peng等[7]发现Akt/mTOR通路的激活可以阻止DDP对卵巢癌细胞的凋亡作用并且引起卵巢癌细胞发生DDP耐药。Fraser等[8]发现Akt可以通过抑制p53的磷酸化和细胞核功能导致人卵巢癌细胞发生DDP耐药。Weng等[9]研究发现下调Akt2可以增加卵巢癌细胞对紫杉醇的敏感性,但目前对PI3K/Akt信号转导通路与多药耐药产生和逆转关系的研究仍较少。

本研究结果表明，SKOV3/DDP细胞中PI3K/Akt蛋白表达水平高于SKOV3细胞，以LY294002抑制PI3K/Akt蛋白表达可增强SKOV3细胞DDP敏感性，特别是在SKOV3/DDP细胞，对DDP敏感性达到其亲本（SKOV3细胞）水平，提示PI3K/Akt信号通路异常与卵巢癌DDP耐药有关，抑制PI3K/Akt信号通路能逆转卵巢癌DDP耐药表型。

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