小檗碱对糖尿病大鼠血管平滑肌细胞增殖影响研究＊
2011-07-16杨静罗岷刘萍方飞刘昌权3
杨静 罗岷 刘萍 方飞 刘昌权3△
（1.宜宾卫生学校药学教研室，四川 宜宾644000；2.宜宾卫生学校生理教研室，四川 宜宾644000；3.宜宾卫生学校内科教研室，四川 宜宾644000）
糖尿病慢性血管病变一直是患者早死及致残的首要原因，糖尿病患者心血管病的发生率也显著高于非糖尿病人群。血管平滑肌细胞（Vascular smooth muscle cells，VSMC）的异常增殖迁移和表型改变是糖尿病慢性血管病变的主要病理学基础，而血管平滑肌的异常增殖可能与核因子－κB激活有关。小檗碱（Berberine）毛茛科植物黄连素根茎中所含的一种主要生物碱，可由黄连、黄柏或三颗针提取，也可人工合成一种抗菌性生物碱，疗效较确切。近年来大量动物实验研究发现小檗碱具有显著的降血糖影响［2］，在血管平滑肌细胞增殖方面也能产生抑制作用［3］。因此，本实验通过培养和建立糖尿病大鼠VSMC模型，观察小檗碱对大鼠VSMC的增殖及NF－κB核转移的影响，评价小檗碱体外抗糖尿病血管病变作用。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 动物
清洁级SD大鼠，雄性，体重200－240g，由泸州医学院实验动物科提供（合格证号：川医动字2401115）。
1.1.2 样品及试剂
小檗碱（陕西森弗生物技术公司，纯度99%，黄色结晶粉末）；链脲佐菌素（STZ）（美国Sigma公司，批号 S0130）；RPMI1640（GIBCO公司）；胰蛋白酶（美国Sigma公司）；胎牛血清（天津灏洋生物制品科技责任有限公司）；CCK－8（碧云天生物技术研究所）；免疫组化染色试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司）；NF－κB激活－核转运检测试剂盒（碧云天生物技术研究所）；DAB显色剂（武汉博士德生物工程有限公司）。
1.1.3 仪器
倒置相差显微镜（日本Olympus公司，CKX41型）；CO2培养箱（日本Sanyo公司，MCO－15AC型）；超净工作台（苏州净化设备有限公司，SW－CJ－1F型）；离心机（北京医用离心机厂，LG10－3A型）；电子天平（上海民桥精密科学仪器有限公司，FA1104N型）；超低温冰箱（日本Sanyo公司，MDF－192型）；高压消毒锅（上海申安医疗器械厂，LDZX－40BI型）；酶标分析仪（北京普朗新技术有限公司，DNM－9602型）；优普超纯水机（成都超纯科技有限公司，UPH－IV－10T型）；激光共聚焦扫描显微镜（德国LEICA公司，TCS SP5型）。日本京都血糖仪（日本爱科来株式会社，GT－1640型）。
1.2 方法
1.2.1 糖尿病大鼠模型建立
大鼠一次性腹腔注射链脲佐菌素（Streptozotocin，STZ，pH 4.5，0.1%枸橼酸缓冲液新鲜配制）55mg·kg－1造糖尿病大鼠模型。72h后采用大鼠断尾取血测血糖值，连续测3d。以血糖水平＞16.7mmol·L－1为糖尿病建模成功。
1.2.2 血管平滑肌细胞的培养
取建模成功大鼠正常喂饲1M后颈椎脱臼处死，75%酒精浸泡2－3min，在无菌环境中迅速取出胸主动脉，剥去血管外膜，去除内膜，取中膜血管平滑肌，剪成1.5－2.0mm3大小的组织块，平铺于培养瓶，加入含血清的RPMI1640，放入37℃、5%CO2培养箱中静置培养3d，倒置显微镜下观察细胞生长状况。
1.2.3 血管平滑肌细胞的鉴定
（1）用相差倒置显微镜观察细胞。（2）SMA免疫组织化学染色：将细胞接种于置有小玻片的6孔板中，培养至细胞成致密单层后取出玻片，PBS冲洗后用冷丙酮固定，二步法进行SMA免疫组织化学染色。
1.2.4 细胞生长曲线测定
取生长良好细胞，胰酶消化后计数，调整细胞为5×104·ml－1接种24孔板。24h后开始计数细胞，以后每隔24h计数一次，每次取3个复孔，连续计数7d，计算平均值。根据结果，以单位细胞数（细胞数·ml－1）为纵坐标，时间为横坐标绘制生长曲线。
1.2.5 小檗碱50%抑制率浓度测定
将96孔板分为空白（培养基）、阴性对照（细胞＋培养基）、药物 对 照 （药 物 ＋ 培 养 基）和 60，30，15，7.5，3.75，1.875μmol·L－1小檗碱组（细胞＋培养基＋药物），取生长良好的糖尿病VSMC细胞，调浓度为1×105·L－1后接种于96孔细胞培养板，采用CCK－8法测定相应的吸光度（Absorbent，A）值，按公式（1－A实验÷A对照）×100%得出不同浓度对应的抑制率，计算50%抑制率浓度（IC50）。
1.2.6 NF－κB核转运检测
调整VSMC细胞浓度为1×105·L－1接种于6孔板中（板中事先放盖玻片），培养1d待细胞贴壁，加入60，30，15，7.5，3.75，1.875μmol·L－1小檗碱培养1d，按 NF－κB激活－核转运检测试剂盒说明书进行操作。于波长460nm处在共聚焦显微镜下观察细胞核、细胞浆颜色，拍照。
1.3 统计学处理
2 结果
2.1 糖尿病血管平滑肌的鉴定
倒置相差显微镜下单个平滑肌细胞呈梭形，扇形或三角形状，有多个细胞突起，胞浆丰富，胞质密度高，不透明，核卵圆形居中，有多个核仁。细胞生长致密时平行排列成束，部分重叠，表现为旋涡状生长，见图1。经特异的平滑肌α－actin免疫细胞化学染色后，胞浆着色，呈阳性反应，高倍镜下可见胞浆内大量棕色、与细胞长轴平行的纤维细丝，即平滑肌α肌动蛋白丝，见图2。
图1 糖尿病血管平滑肌第五代照片（×100）
图2 糖尿病血管平滑肌细胞的α－SM action鉴定
2.2 正常组与糖尿病组大鼠血管平滑肌生长曲线比较
可见两者细胞增长程度与天数呈S型关系，但糖尿病组血管平滑肌生长速度比正常组快（图3）。
图3 糖尿病大鼠与正常组VSMC生长曲线比较
2.3 小檗碱50%抑制率浓度
小檗碱对糖尿病血管平滑肌细胞增殖抑制呈明显的剂量相关性，其IC50值为6.001±0.853μmol·L－1。小檗碱对正常血管平滑肌细胞生长有一定抑制作用，其IC50值为18.229±0.434μmol·L－1同模型组比较有显著差异性（P＜0.05）。
2.4 小檗碱对VSMCs中NF－κB核转位的影响
正常组血管平滑肌细胞呈梭形，扇形或三角形状，散在成簇生长，胞质中有中等强度红色荧光着色，胞核为蓝色荧光着色（图4A），糖尿病组VSMCs胞质中红色着色稍减弱，胞核中红色荧光着色强（图4B），小檗碱组可见胞质中的红色较糖尿病组强，正常组弱，胞核中红色着色较模型组弱，正常组强（图4C）。
图4 不同状态下糖尿病大鼠VSMCs中NF－κB分布 （×200）
3 讨论
糖尿病患者发生心血管并发症的危险性较正常人高3－4倍，糖尿病大血管并发症是造成糖尿病病人残疾和死亡的主要原因之一，最常见的表现就是发生动脉粥样硬化，常累及大血管［4］。VSMC是动脉壁的主要成分，在血管内膜增生及血管重塑中起重要作用。糖尿病慢性血管病变的主要发病机制VSMC增殖并迁移入内膜，同时产生过量的细胞外基质，导致纤维组织增生，最终形成斑块或血拴［5］。
NF－κB是存在于细胞浆中的一种快反应转录因子，参与了动脉粥样硬化的过程。研究显示动脉粥样硬化的VSMC和巨噬细胞中都大量存在激活的NF－κB［6］。Ramana KV等的研究直接证明了NF－κB调节VSMC增殖的重要作用［7］。NF－κB激活参与糖尿病血管病变也得到了证实：糖尿病时，在某些刺激因素如AGEs、氧化应激、脂代谢紊乱及细胞因子等的作用下，NF－κB被激活后即发生核转位，P65亚基由胞质转移至胞核，与特定基因启动子或增强子上的特异性反应元件结合，调节基因转录，启动血管细胞粘附分子－1（VCAM－1）合成，促进单核细胞与血管内皮细胞的粘附，从而导致动脉粥样硬化的发生［8］。
本研究观察到体外培养糖尿病VSMC生长速度明显高于正常血管平滑肌，同时糖尿病大鼠VSMC出现NF－κB的核转移，提示糖尿病 VSMC有异常增殖，NF－κB在糖尿病大鼠VSMC中出现激活，与文献报告一致。采用小檗碱干预后，小檗碱各剂量组明显抑制血管平滑肌的增殖，并抑制了NF－κB的核转移，提示小檗碱能够抑制糖尿病血管平滑肌的异常增殖，而此作用可能与抑制NF－κB的核转移有关。至于与其他血管异常增殖因素有无关系尚需进一步研究。
1 李艳平，李新荣，邓湘蕾.糖尿病大鼠血管平滑肌细胞体外培养方法的探讨［J］.东南大学学报（医学版），2005，24（3）：186－189.
2 殷俊，陈明道，唐金凤，等.小檗碱对实验大鼠糖脂代谢的影响［J］.中华糖尿病杂志，2004，12（3）：215－218.
3 陈少萍，陈少慈.小檗碱对肺动脉平滑肌细胞增殖的影响［J］.汕头大学医学院学报，2008，21（2）：78－83.
4 姚君厘.糖尿病和大血管病变［J］.上海医药，2006，27（6）：253－256.
5 陈柏华.宽叶缬草对兔血管平滑肌细胞增殖及迁移抑制作用的实验研究［J］.数理医药学杂志，2004，17（3）：281－282.
6 庞荣清，潘兴华，吴亚玲.三七总皂甙对兔血管平滑肌细胞核因子－κB和细胞周期的影响［J］.中国微循环，2004，8（3）：154－156.
7 Ramana KV，Chandra D，Srivastava S，et al.Aldose reductase mediatesmitogenic signaling in vascular smooth muscle cells［J］.J Biol Chem，2002，277（35）：32063－32070.
8 王芙蓉，高聆，于建中，等.西洛他唑对糖尿病大鼠主动脉VCAM－1 NF－κB及PPARs的影响［J］.中国药理学通报，2006，22（2）：197－202.
