左西孟旦对大鼠离体心脏缺血再灌注损伤的保护作用

于明懂 高春霖 吕国义 邓廼封

心脏停搏液在心脏外科手术期间具有良好的心肌保护作用，其作用直接关系到手术成功与否及术后心功能的恢复情况。左西孟旦（1evosimendan，Levo）是新一代Ⅱ型钙离子（Ca2+）增敏剂，对缺血-再灌注心肌有良好的保护作用，能开放ATP敏感的K+通道（KATP）而具有药物学缺血预处理作用[1]。本研究旨在观察在去极化心脏停搏液中加入不同浓度左西孟旦对缺血再灌注心肌损伤的影响，并分析其可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物和分组 健康雄性Wistar大鼠32只，体质量250～300 g，购于北京军事医学科学院实验动物中心，清洁级，随机分为4组（n=8），L0组为对照组：用去极化停搏液St.Thomas’Ⅱ（STH-2）停搏；L0.03组：STH-2中加入 Levo 0.03 μmol/L；L0.3组：STH-2加入Levo 0.3 μmol/L；LG组：STH-2中加入Levo 0.3 μmol/L和格列苯脲10 μmol/L停搏。

1.2 主要试剂及仪器 左西孟旦（常州亚邦制药有限公司），格列苯脲（上海化学试剂厂）。K-H液（mmol/L）:NaCl 118.5、KCl 4.8、葡萄糖 11.0、CaCl21.8、KH2PO41.2、NaHCO325.0、Mg⁃SO4·7H2O 1.2。STH-2 停 搏 液（mmol/L）:NaCl 110.0、KCl 16.0、CaCl21.2、NaHCO310.0、MgCl·26H2O 16.0（所有试剂均为国产分析纯）。磷酸肌酸激酶（CK）、乳酸脱氢酶（LDH）试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。改良Langendorff灌注模型（国产自组装）；BS223S电子分析天平（北京赛得利斯仪器系统有限公司），cc7-104-23-017型DATEX多功能监测仪（Datex公司,芬兰），SCW-PTO1型压力传感器（深圳益心达医学新技术有限公司）。

1.3 实验方法

1.3.1 动物模型的建立 于大鼠腹腔注射3%戊巴比妥30 mg/kg、肝素500 IU/kg，麻醉后迅速开胸取出心脏，放入盛有4℃K-H液的玻璃皿中，修剪主动脉根部周围组织，游离主动脉，悬挂于改良Langendorff心脏灌流装置上，结扎固定，恒压灌注，剪开肺动脉圆锥以开放冠脉流出道，剪开左心耳，将与压力传感器连接的乳胶水囊经左心房通过二尖瓣置于左心室，然后将心脏置于37℃保温缸内，向球囊内缓慢注入生理盐水，调解乳胶水囊压力，使左心室舒张末压（LVDP）维持在8～10 mm Hg（1 mm Hg=0.133 kPa）。各组均由主动脉恒压灌注预先升温至37℃，并用95%O2与5%CO2混合气体持续充气平衡30 min的K-H液，灌注压力为90 cm H2O（1 cm H2O=0.098 kPa）。30 min后分别用相应25℃心脏停搏液诱导心脏停搏，灌注流量为15 mL/kg，灌注压为90 cm H2O，每30 min灌注1次。停搏期间各组心脏分别浸泡在相应的25℃恒温的停搏液中，120 min后以K-H液恢复灌注30 min。

1.3.2 测量及观测指标 测定心脏停搏前即刻（T0）、再灌注10 min（T1）、20 min（T2）、30 min（T3）时的心率（HR）、LVDP及左心室内压力上升/下降速率（±dp/dtmax），并以T0时各项指标作为基础值计算再灌注后各时间点的恢复率（当前值/基础值）。留取T0、T32个时间点冠脉流出液2 mL，用于检测LDH和CK。

1.4 统计学方法 应用SPSS 17.0软件包进行统计学分析，数据以均数±标准差±s）表示，采用单因素方差分析，两两比较采用SNK-q检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 血流动力学指标恢复率的比较 各组心功能基础值差异无统计学意义（P>0.05）；再灌注期各组心功能都有不同程度的降低，L0.3组LVDP、±dp/dtmax的恢复率均高于其他3组（P<0.05或P<0.01），HR的恢复率明显高于L0组（P<0.01），L0.03组、LG组与L0组比较HR、+dp/dtmax的恢复率差异无统计学意义（P>0.05），-dp/dtmax恢复率在T2时点高于L0组（P<0.05），见表1～3。

表1 缺血前即刻各组心功能指标比较 （n=8，±s）

表1 缺血前即刻各组心功能指标比较 （n=8，±s）

均P>0.05

L0组L0.03组L0.3组LG组F HR（次/min）283.63±14.06 280.75±16.10 281.50±10.94 282.38±11.61 0.069 LVDP（mm Hg）89.44±3.19 88.56±2.50 89.90±4.01 88.87±4.53 0.212+dp/dtmax（mm Hg/s）2 407.07±168.19 2 336.69±206.72 2 382.80±189.83 2 374.38±209.63 0.181-dp/dtmax（mm Hg/s）1 450.10±148.05 1 408.13±176.18 1 424.63±152.70 1 431.87±168.18 0.093组别

表2 再灌注期各时间点HR、LVDP恢复率比较（n=8，%±s）

表2 再灌注期各时间点HR、LVDP恢复率比较（n=8，%±s）

*P<0.05，**P<0.01；表3～4同

L0组（1）L0.03组（2）L0.3组（3）LG组（4）F q（1）∶（2）（1）∶（3）（1）∶（4）（2）∶（3）（2）∶（4）（3）∶（4）T1 86.00±2.64 87.89±1.80 90.55±2.18 88.42±4.08 3.558*1.909 4.596**2.444 2.687 0.535 2.152 T2 89.80±2.84 90.70±2.52 93.88±1.00 91.48±3.56 3.471*0.961 4.354**1.793 3.394*0.832 2.561 T3 86.79±3.09 88.89±3.44 91.63±3.16 89.61±3.43 2.956*1.809 4.16**2.429 2.360 0.620 1.740 T1 45.55±3.47 48.13±3.25 55.83±2.88 49.59±2.90 11.386**2.027 8.075**3.174 6.049**1.147 4.870**T2 55.42±3.01 61.49±3.11 73.47±3.23 59.79±3.65 20.431**4.230*12.578**3.045 8.307**0.488 9.533**T3 54.89±2.94 60.94±2.76 72.30±3.41 58.37±3.86 18.754**4.356*12.534**2.505 8.179**1.850 10.029**HR LVDP组别

表3 再灌注期各时间点±dp/dtmax恢复率比较（n=8，%±s）

表3 再灌注期各时间点±dp/dtmax恢复率比较（n=8，%±s）

L0组（1）L0.03组（2）L0.3组（3）LG组（4）F q（1）∶（2）（1）∶（3）（1）∶（4）（2）∶（3）（2）∶（4）（3）∶（4）T1 45.34±3.96 47.92±5.10 56.27±4.75 49.64±5.35 7.501*1.514 6.414**2.523 4.900**1.009 3.891*T2 58.03±4.50 60.32±4.04 75.69±3.46 61.17±5.18 27.418**1.492 11.509**2.046 10.016**0.554 9.462**T3 57.22±3.32 60.56±3.02 73.57±3.74 59.70±4.96 29.393**2.466 12.069**1.831 9.604**0.635 10.239**T1 46.87±3.69 48.70±4.39 57.24±3.48 48.16±3.28 12.872**1.387 7.862**0.978 8.540**0.409 6.884**T2 55.96±3.47 60.54±3.16 71.72±3.65 59.75±4.34 27.186**3.517*12.101**2.910*8.584**0.607 9.191**T3 55.31±1.84 58.90±4.00 68.28±4.71 57.35±3.60 19.374**2.755 9.953**1.565 7.198**1.189 8.388**+dp/dtmax -dp/dtmax组别

2.2 CK和LDH漏出量的比较 各组CK及LDH基础值比较差异无统计学意义（P>0.05），复灌后各组CK及LDH漏出量均明显升高（P<0.01），L0.3组漏出量少于其他3组（P<0.05或P<0.01），L0.03组与L0组相比也明显减少（P<0.05），LG组与L0组、L0.03组相比差异均无统计学意义（P>0.05），见表4。

表4 各组CK和LDH测定结果比较（n=8，U/L±s）

表4 各组CK和LDH测定结果比较（n=8，U/L±s）

T3t T0T3t T0 CK LDH组别57.28±7.17 50.39±4.72 44.10±5.17 51.68±5.00 7.466**3.480*6.658**2.829 3.177*0.647 3.829*11.955**12.658**10.320**13.661**125.66±15.37 122.79±17.17 119.91±12.65 120.59±15.28 0.233- - - - --237.33±22.51 215.29±21.95 194.11±16.17 220.29±18.51 6.368**3.124*6.126**2.415 3.002*0.709 3.717*19.321**12.777**13.777**17.161**21.53±2.16 22.18±2.45 20.90±3.81 20.62±3.58 0.408- - - - --L0组（1）L0.03组（2）L0.3组（3）LG组（4）F q（1）∶（2）（1）∶（3）（1）∶（4）（2）∶（3）（2）∶（4）（3）∶（4）

3 讨论

去极化高钾停搏液应用于心外手术已有几十年历史，高钾停搏液可以使心脏快速停搏，由于其配制简便和费用低廉，在临床上得到广泛地应用。高钾心脏停搏液的缺点是可以造成心肌局灶性坏死和冠状动脉内皮细胞的损伤，同时由于STH液在较长的心脏外科手术中常需多次灌注，因而可加重心肌水肿，造成心肌损害[2]。近年来，国内外的研究证明在停搏液中添加药物成分对心肌具有额外保护的作用，如左旋卡尼汀[3]、丹参[4]等。

心肌细胞KATP分为肌浆网KATP（sacrKATP）和线粒体KATP（mitoKATP），发挥作用的方式各有不同。导致细胞不可逆损伤的根本原因是线粒体Ca2+超载。线粒体高浓度的Ca2+导致线粒体渗透性转换孔永久性开放，它允许高分子质量的物质出入线粒体，使线粒体内容物丧失，膜电位永久消失，水分子大量进入线粒体内，导致线粒体肿胀甚至崩解[5]。

Levo是新一代Ⅱ型Ca2+增敏剂，不同的浓度下具有Ca2+增敏、开放KATP、抑制磷酸二酯酶、促进NO合成及抗炎抗氧化等作用[6]。在心脏，Levo可激活sacrKATP而产生舒张冠状动脉的作用[7]。Levo也可激活mitoKATP通道引起线粒体K+内流，从而具有药物缺血预处理作用[1]。Levo具有很好的药理学预处理作用，能够减小心肌的再灌注损伤[8]。mitoKATP比sacrKATP在心肌保护中的作用更重要，Levo激活mito⁃KATP通道是其产生心肌保护作用的基本机制，mito⁃KATP通道的开放通过调节线粒体内钙超载而发挥了有益的作用。当mitoKATP通道短暂开放时，导致K+净摄入增加从而耗散线粒体内膜电位，使电子传递解偶联，降低Ca2+在线粒体内的积聚，最终阻止线粒体内Ca2+超载。

LVDP、±dp/dtmax、HR是心功能的主要参数，本研究比较各心功能指标的恢复率，能准确地反映出心功能的恢复情况，增加了可比性。CK、LDH是与心肌损伤密切相关的酶，心肌组织坏死时血清CK、LDH含量明显升高，且上升幅度可在一定程度上反映心肌细胞损伤程度。本研究结果表明，再灌注后L0.3组的各时间点心功能指标恢复率明显高于L0组，再灌注末冠脉流出液中CK和LDH的含量明显低于L0组，表明加入Levo后再灌注期心肌细胞的损伤得到了明显的改善。同时L0.3组与L0.03组、LG组相比心功能恢复率、CK和LDH的含量均有不同程度的改善，而L0.03组与L0组相比，CK和LDH的水平均下降，说明Levo的作用效果和其浓度有一定关系，0.3 μmol/L浓度的心肌保护效应优于0.03 μmol/L。格列苯脲为KATP特异阻滞剂，加入格列苯脲以后Levo对缺血再灌注心肌的保护作用几乎被消除，提示开放KATP为Levo发挥心肌保护作用的主要途径。

笔者认为在去极化停搏液中加入Levo后，其发挥作用的主要方式为激活mitoKATP稳定了线粒体膜，在长时间的心脏停搏期减少离子紊乱，从而减少线粒体水肿和钙超载，保护了线粒体的结构和功能。有助于改善再灌注后心肌能量代谢紊乱，发挥心肌保护作用。而激活sacrKATP产生的冠脉舒张作用在此心肌停跳期间发挥的作用甚微。由于本研究是实验研究，与临床研究有一定差异，加之实验条件和环境有限，实验分组和例数较少,未进行光镜、电镜下的比较等，因此有关内容还需进一步研究。

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