穿龙薯蓣皂苷对障碍再生性贫血小鼠骨髓T细胞亚群的影响*

张伟锋，刘宝山

300193 天津中医药大学第一附属医院（刘宝山）

再生障碍性贫血（简称再障）是造血系统的常见疾病,其发生的确切机制至今尚未完全阐明，目前多数学者认为再障的主要发病机制是免疫异常，而造血微环境与造血干/祖细胞量的改变是异常免疫损伤所致，其中T细胞亚群的异常在再障的发病过程中有着重要的作用[1]。

穿山龙是薯蓣科薯菠属植物穿龙薯蓣（Dioscorea napponica.Mak）的根茎，具有活血舒筋、祛痰截疟、消食利水之效[2]，穿龙薯蓣的主要化学成分为甾体皂苷类、是用于合成多种载体激素类药物的重要原料之一，具有调节机体免疫的作用[3-5]。笔者应用穿龙薯蓣皂苷治疗再生障碍性贫血小鼠，观察其对骨髓T细胞亚群的表达的影响，报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物 近交系ICR小鼠，雌雄各半，6～8周龄，体质量（20±2）g（以上动物均购自中国医学科学院放射研究所，经检疫合格，合格号（SCXK<京>2009-0004）。

1.2 实验用药 薯蓣皂苷片（东盛科技股份有限公司西安制药厂生产，产品批号：200907035）。环孢素软胶囊（华北制药股份有限公司生产，产品批号：100501），雷公藤多苷片（浙江得恩德制药有限公司，产品批号：1007119）。

1.3 实验试剂 环磷酰氨（CY），江苏恒瑞医药股份有限公司，10051421。氯霉素（CH），上海生工有限公司，CB0118-109。淋巴细胞分离液，中国医学科学院血液学研究所无酚红RPMI1640培养液，美国GBICO公司。优质胎牛血清，德国BIOCHROM AG公司。PE/Cy5 anti-mouse CD4，美国BD公司。PE anti-mouse CD8a，美国BD公司。FITC anti-mouse CD3，美国BD公司。

1.4 实验仪器 超净工作台，苏州净化设备厂。恒温CO2培养箱，美国Fisher公司。25 mL培养瓶，美国Corning公司。离心机，北京医用离心机厂。倒置相差显微镜，日本Olnyrpus公司。流式细胞仪，美国Conlter制造厂。

1.5 方法

1.5.1 再障模型的建立 参照孙纪元等[1]报道方法，ICR 小鼠经 60Coγ 射线（3Gy，剂量率 0.6，照射时间5min，距离4m）全身照射后，于第4、5、6天腹腔注射环磷酰氨（CY）50 mg/kg，氯霉素(CH)62.5 mg/kg，每日1次；正常对照组行假照射（铅砖屏蔽），于第4、5、6天腹腔注射等体积生理盐水。第7天，随机抽查造模小鼠外周血象、骨髓象，验证成模。

1.5.2 分组与处理 选取健康ICR小鼠105只，适应性喂养7 d，按随机数字表法随机选出15只设为正常对照组，其余随机分为6组（模型组、西药对照环孢素组、中药对照雷公藤多苷组、中药治疗高剂量组、中药治疗中剂量组、中药治疗低剂量组），每组15只。分别为：1）正常对照组、模型组灌胃生理盐水，每次0.2 mL，每日1次。2）西药对照组：成模后予以环孢素软胶囊23.5 mg/（kg·d），灌胃，每日1次。3）中药对照组：成模后予以雷公藤多苷9.36mg/（kg·d），灌胃，每日1次。4）低剂量组：成模后予以薯蓣皂苷37.44 mg/（kg·d），灌胃，每日1次。5）中剂量组：成模后予以薯蓣皂苷74.88 mg/（kg·d），灌胃，每日1次。6）高剂量组：成模后予以薯蓣皂苷149.76mg/（kg·d），灌胃，每日1次。第7～14天，各组连续灌胃，第15天定为取材时间。

各组用药参照成人剂量：环孢素软胶囊150mg/d，雷公藤多苷片60 mg/d，薯蓣皂苷片低、中、高剂量分别为240，480，960 mg/d。参考陈奇《中药药理研究方法学》，按照“动物体表面积比率换算等效剂量法”计算小鼠给药量。

1.5.3 小鼠骨髓单个核细胞（BMMNC）分离培养治疗后第15天，断颈处死小鼠，无菌条件下取双侧股骨，用带有5号针头的5 mL注射器吸取RPMI1640培养液，反复冲洗骨髓腔，将骨髓细胞收集在灭菌离心管内，并反复吹打，使骨髓细胞充分分散，制成悬液。将充分混匀的细胞悬液以1∶1比例加在淋巴细胞分离液的表面上，离心2 000 r/min，10 min，分离出单个核细胞层，移入1个5 mL离心管内。加入磷酸盐缓冲液（PBS）2 mL，反复吹打，离心1 000 r/min，10 min，去上清液，洗两次。用3mL1640培养液（青霉素0.073 7g/L、链霉素0.171 7g/L，碳酸氢钠2g/L，10%胎牛血清）悬浮沉淀细胞，制成悬液计数，经台盼蓝鉴定细胞活性在95%以上，将悬液移入25 mL培养瓶中置于37℃、5%二氧化碳（CO2）饱和湿度培养箱内培养24 h。将培养后细胞消化后吸取移入离心管中，离心1000r/min，10min。收集培养上清液及BMMNC，流式细胞仪检测。

1.5.4 骨髓CD3+、CD4+、CD8+检测 将上述培养后的细胞吹打后移入离心管中，制成骨髓单个核细胞悬液，将细胞浓度调至 1×106细胞/mL。取悬液 100 μL，分别加入免疫荧光抗体FITC anti-mouseCD31 μL、PE/Cy5anti-mouseCD41μL、PEanti-mouseCD8a1μL。4℃，避光孵育 30min，PBS（7.2～7.4）缓冲液洗涤 2 次，离心，1 000 r/min，5 min，弃上清液，补足0.5 mL PBS，上流式细胞仪检测、分析，设立阴性对照。

2 结果

2.1 各组外周血血象比较 见表1。

表1 治疗后各组外周血细胞计数s）

表1 治疗后各组外周血细胞计数s）

注：与正常组比*P＜0.05；与模型组比△P<0.05；与CsA组▲P<0.05；与雷公藤组比▲▲P<0.05。

组别 n 白细胞（×109） 血红蛋白（g/L） 血小板（×109）正常组 15 13.50±3.36 172.50±41.62 800.30±36.94模型组 10 1.57±0.40 77.47±10.71 268.73±29.38低剂量组 11 5.76±0.70*△▲ 100.70± 5.67*△▲ 441.70±43.47*△▲中剂量组 12 11.97±2.02△▲▲ 139.08±11.70△▲▲ 730.08±99.6△▲▲高剂量组 11 8.72±2.15*△▲▲114.60± 4.95*△▲▲651.50±45.24*△▲▲Cs A 组 11 8.86±1.49 115.91± 5.20 529.45±30.42雷公藤组 10 5.69±1.21 98.64± 7.09 412.18±39.98

治疗后各治疗组与模型组、正常对照组比较差异均有显著性。穿龙薯蓣皂苷低、中、高3组组间比较差异具有统计学意义（P＜0.05），以中剂量组最优。其与两者阳性药物对照组比较均具有显著差异（P＜0.05）。

2.2 再障小鼠骨髓象比较 正常对照组骨髓增生活跃，骨髓小粒造血细胞丰富。模型组骨髓粒系、红系、巨核系三系增生减低，骨髓非造血细胞较多。治疗后各组骨髓增生比较活跃，骨髓小粒造血细胞不同程度恢复，穿龙薯蓣皂苷中剂量组优于低、高剂量组及各阳性对照组。

2.3 各组小鼠骨髓CD3+、CD4+、CD8+检测 见表2。

表2 小鼠骨髓 CD3+、CD4+、CD8+表达（±s）%

表2 小鼠骨髓 CD3+、CD4+、CD8+表达（±s）%

注：与正常组比较*P<0.05，与模型组比较△P<0.05，与CsA组比较▲P<0.05，与雷公藤组比较▲▲P<0.05。

组别 CD3+ CD4+ CD8+ CD4+/CD8+正常组 74.6±2.29 49.54±1.66 25.87±1.91 1.71±0.17模型组 60.42±1.40* 39.26±1.89* 39.76±1.61* 1.06±0.25*低剂量组 65.57±2.13*△ 43.94±1.30*△ 38.26±1.14* 1.13±0.11*中剂量组 73.18±1.50△▲▲ 49.82±1.70△▲▲26.02±1.83△▲▲1.80±0.27△▲▲高剂量组 72.99±1.87△▲▲ 47.98±1.38△▲▲37.17±2.31* 1.26±0.21*CsA 组 68.23±1.32*△ 44.67±1.68*△ 36.93±1.46* 1.16±0.24*雷公藤组 62.84±0.92*△ 43.55±1.50*△ 37.81±2.03* 1.15±0.13*

CD3+和CD4+表达模型组低于正常组（P<0.05），CD8+表达模型组高于正常组（P<0.05），治疗各组与模型组相比均有差异有统计学意义（P<0.05），其中中、高剂量组与正常组相比差异无统计学意义（P>0.05），中、高剂量组与两阳性对照组相比差异均有统计学意义（P<0.05）。

CD4+/CD8+比值：模型组低于正常组（P<0.05），中剂量组与模型组相比差异有统计学意义（P<0.05），治疗组与模型组相比差异无统计学意义（P>0.05）。

3 讨论

根据再障的发病特点及临床表现，中医学可将其归属于“虚劳”、“血虚”、“血证”等范畴，中医认为“肾主骨，生髓”、“血者水谷之精也，生化于脾”，认为病机以脾肾为本，尤与肾关系密切，病机关键在于“肾虚”，补肾治疗是中医药治疗再障的重要法则，但又因其病程迁延，日久难愈，固有“久病必瘀”之说，研究表明中药穿龙薯蓣有化痰活血之功效，并有免疫调节作用。故笔者应用穿龙薯蓣皂苷治疗再障小鼠，以观察其疗效，探讨其免疫作用机制。

T淋巴细胞亚群是机体免疫系统中主要的调节因子及效应细胞，它可通过对抗原识别、处理、递呈等引起多种细胞因子同多种细胞之间的网络联系，从而构成维持机体免疫功能的生理状态。参与免疫应答的主要T细胞为CD3+、CD4+和CD8+细胞。

本实验研究结果显示再障模型组小鼠骨髓CD3+、CD4+的表达明显低于正常对照组（P<0.05），CD8+的表达高于正常对照组，CD4+/CD8+比值显著低于正常对照组。给予穿龙薯蓣皂苷治疗后，低、中、高剂量组CD3+、CD4+的表达以及CD4+/CD8+比值明显高于模型组（P<0.05），且中、高剂量组与阳性对照组比较差异均有统计学意义（P<0.05）。说明穿龙薯蓣皂苷能调节提高再障小鼠骨髓CD3+、CD4+的表达，抑制小鼠骨髓CD8+的表达，促进CD4+/CD8+比值的恢复，从而抑制骨髓T细胞的异常激活，促进骨髓造血功能的恢复。

[1]徐淑芬，白 海，王存邦，等.再生障碍性贫血患者骨髓T细胞亚群与免疫抑制治疗疗效的关系[J].西北国防医学杂志，2010,31（6）：401-403.

[2]江苏新医学院.中药大辞典[M].上海：上海人民出版社，1977:1726.

[3]于海荣，工济兴，陈建双，等.穿山龙总皂昔含药血清对小鼠脾淋巴细胞增殖及IL-6产生影响的实验研究[J].江苏中医药，2007，39（1）：57-58.

[4]王济兴，张风英，宋鸿儒，等.穿山龙总皂苷对大鼠T淋巴细胞功能影响的血清药理学研究[J].时珍国医国药，2006，17(9):1653-1654.

[5]舒 艳.穿龙薯蓣抗癌活性成分的研究[D].沈阳：沈阳药科大学，2006：251.

[6]孙纪元,王四旺,施新猷,等.再生障碍性贫血的动物模型实验研究[J].中国实验动物学杂志,2000,10(4):210-211.