香加皮抗心力衰竭有效部位的制备工艺研究*

杨 虹，刘 虹，任晓亮，王 萌，朱晓月

剂学重点实验室（刘 虹，任晓亮，王 萌，朱晓月）

香加皮（Cortex Periplocae）是萝藦科植物杠柳（Periploca Sepium Bge.）的干燥根皮，因其含有强心苷成分，常用于治疗急、慢性充血性心力衰竭。香加皮的临床应用通常以汤剂、药材粉末或粗提物入药，服用不便，患者顺应性较差；而且药材中主要的强心苷成分杠柳毒苷的含量波动会造成制剂的质量不稳定，不利于临床用药的安全、有效。

中药有效部位采用现代工艺有效去除杂质、保留了有效成分，其有效成分含量达到50%以上，在保留原药材功效的同时，实现了传统中药的精制。文献中根据活性成分的不同性质及在原料药材中的不同含量采用的方法有：大孔树脂法、分子蒸馏法、聚酰胺层析法、硅胶柱层析法、酸碱沉淀法等[1-2]。本研究在专利技术香加皮提取物[3]的基础上，采用制备性快速柱结合精制柱进行香加皮抗心力衰竭有效部位的工艺研究。

1 仪器与试药

旋转蒸发仪（上海亚荣生化厂），Waters 515高效液相色谱法（HPLC）。杠柳毒苷对照品（天津中医药大学中医药研究院，质量分数98%以上）；香加皮提取物（天津中医药大学中医药研究院）；柱色谱硅胶（100～200目，青岛海洋化工厂）；乙酸乙酯（分析纯，天津市北方天医化学试剂厂）；无水乙醇（分析纯，天津市北方天医化学试剂厂）；乙腈（色谱纯，天津市康科德科技有限公司），超纯水（美国Millipore超纯水制备系统），甲醇（色谱纯，天津市康科德科技有限公司）。

2 方法与结果

采用制备性快速柱结合精制柱分步富集的方法，逐级提高杠柳毒苷的含量，以达到制备工艺的稳定、可靠、经济。以香加皮提取物（经大孔树脂处理，简称干膏1，杠柳毒苷含量2%～5%）为起点，通过制备性快速柱，采用低极性溶剂洗脱，使杠柳毒苷含量富集到20%～30%，得干膏2；再通过精制柱进行梯度洗脱，制得杠柳毒苷含量大于50%的有效部位。工艺路线见图1。

图1 香加皮抗心衰有效部位制备工艺路线图

2.1 制备性快速柱工艺考察及验证 杠柳毒苷的HPLC含量测定方法见参考文献[4]。第1步富集所采用的制备性快速柱是利用低极性溶剂、短柱、超载实现杠柳毒苷含量的初步提高。考虑到溶剂的低毒性，确定采用乙酸乙酯∶乙醇（25∶1）为洗脱溶剂，对干膏1与硅胶质量比例进行了考察。

2.1.1 干膏1与硅胶质量比例的考察 取5g干膏1，适量乙醇溶解，与10g硅胶混合制样，分别另取10、20、40g硅胶干法装柱（按干膏1与硅胶质量比例分别称为 1∶4 柱、1∶6 柱、1∶10 柱），上样，以乙酸乙酯∶乙醇（25∶1）为洗脱溶剂，每 200 mL 为 1 份，用薄层色谱法（TLC）（展开剂为氯仿—甲醇—水65∶30∶10的下层，3，5-二硝基苯甲醛显色）追踪杠柳毒苷；减压蒸干后用HPLC法测定各份固体中杠柳毒苷含量。HPLC测定结果见图2。

由图2可以看出：随着硅胶用量的增多，所得杠柳毒苷最高含量略有升高。选取TLC中有明显强心苷斑点的洗脱部分，合并后减压蒸干回收溶剂，得干膏2，测定其中杠柳毒苷含量，计算杠柳毒苷转移率，结果见表1。

表1 不同比例干膏1与硅胶所制备的杠柳毒苷含量及转移率

综合考虑所得干膏2中杠柳毒苷含量、转移率及节省硅胶降低成本的需要，确定采用1∶6柱，即干膏1与硅胶用量之比为1∶6进行第1步富集。

2.1.2 工艺验证 对所确定的制备性快速柱工艺进行了多批次的验证，结果见表2。所得干膏2杠柳毒苷平均含量为23.54%，杠柳毒苷转移率平均为72.40%。

2.2 精制柱工艺考察及验证 第2步富集采用硅胶长柱、梯度洗脱使杠柳毒苷含量达到50%以上。

2.2.1 对硅胶柱径高比的考察 以干膏2为原料，1∶2硅胶比例制砂，湿法装两根硅胶柱，径高比分别为 1∶9 和 1∶14，以乙酸乙酯∶乙醇梯度洗脱，薄层色谱法（TLC）追踪杠柳毒苷，合并斑点颜色最深的2～3份，减压蒸干回收溶剂，得干膏3，HPLC法测定其中杠柳毒苷含量，结果见表3。由表3可见，1∶14柱所得干膏3杠柳毒苷含量及收率均比1∶9柱高，因此确定采用1∶14柱，所得干膏3中杠柳毒苷含量达到50%以上，为香加皮抗心力衰竭有效部位。

表2 制备性快速柱验证结果

表3 不同径高比精制柱制备结果

2.2.2 工艺验证 取5g干膏2按1∶2硅胶比例制砂，按照2.2.1确定的径高比1∶14装柱，以乙酸乙酯∶乙醇梯度洗脱，将TLC中强心苷颜色最深的2～3份合并，蒸干，HPLC法测定杠柳毒苷含量，计算杠柳毒苷转移率。共重复10批，结果见表4。所得有效部位平均杠柳毒苷含量为58.23%，本步骤杠柳毒苷转移率平均为60.12%。

表4 精制柱验证结果

3 讨论

中药有效部位的研究是实现中药现代化的有力手段之一。本研究制得的香加皮抗心力衰竭有效部位中杠柳毒苷含量较高，达50%以上。相对于一般香加皮提取物而言，有效部位服用量小，便于制成注射剂、滴丸剂、缓控释制剂等多种现代剂型，既能方便临床应用，又可提高患者顺应性；而且便于进行质量控制。

曾以干膏1为原料，乙酸乙酯为溶剂，进行索氏提取，提取液蒸干后测定其中杠柳毒苷含量。结果表明，索氏提取前后杠柳毒苷含量没有明显提高。因此直接用制备性快速柱对杠柳毒苷进行富集。

在本研究中制备性快速柱参考了TLC法中杠柳毒苷的吸附行为。在TLC中，当点样量较小时，乙酸乙酯不能使强心苷类成分从硅胶上解吸附，所以展开后杠柳毒苷斑点基本保持在原点不动；而点样量较大即发生样品过载时，杠柳毒苷会从硅胶上解吸附，从而使强心苷斑点位置上移。这就预示着如果采用短柱、超载上样、并选用低极性洗脱剂，可使杠柳毒苷从硅胶柱上洗脱下来，而大部分极性较大的杂质仍被吸附在硅胶上，从而实现除杂、富集有效成分的目的。本实验所选用的制备性快速柱，与普通的硅胶柱相比，上样量大，生产周期缩短；低极性溶剂的使用，可造成极性较大的杂质在硅胶上死吸附，除杂效果明显，从而实现杠柳毒苷的快速富集。

本研究制备性快速柱和精制柱都选择乙酸乙酯∶乙醇作为洗脱溶剂，所选用的溶剂安全低毒，适宜在工业生产中应用。本研究制定的工艺路线重复性较强，进行了多批次制备，即使原料含量有所波动，也可制备出有效部位，且收率基本稳定，说明本实验制定的香加皮抗心力衰竭有效部位的生产工艺安全、稳定、重复性强。成本估算：计算使用的药材、试剂、耗材、水电费，每毫克有效部位的成本不足1元，成本低廉，具有市场开发价值。

[1]高 英,李为民,倪 晨,等.分子蒸馏技术在分离苍术油有效部位中的应用[J].广州中医药大学学报，2004，21（6）：476－478.

[2]佘白蓉，秦达念，佘运初.淫羊藿总黄酮精制方法的建立[J].中华实用中西医杂志，2003，3（16）：1642－1643.

[3]刘 虹，孙 巍，王 萌，等.正交实验优化香加皮药材的提取[J].天津中医药大学学报，2006，25（1）：38-40.

[4]刘 虹，潘桂湘，高秀梅,等.HPLC法测定香加皮中杠柳毒苷的含量[J].中草药，2004，35（5）：578，596.