黑曲霉降解水解单宁培养条件的研究

天津市畜牧兽医研究所 乔家运 李 平 陈龙宾 王文杰＊

单宁也称单宁酸，是一种存在于植物中的水溶性聚酚类物质，分子质量为500～3000 Da。单宁的化学性质活泼，饲料中的单宁易与蛋白质结合，因此具有抗营养作用；单宁抑菌作用的存在，也会限制食草动物对营养物质的利用（Frazier等，2010；Getachew 等，2008；Li等，2006）。 采用生物降解的方法，开展了对植物单宁生物降解的研究，通过单宁降解菌的作用，将分子质量较大的单宁降解为小分子化合物，从而降低或消除单宁的抗营养作用。在前期的研究中，从霉变葡萄中筛选出了一株具有单宁降解能力的黑曲霉 （乔家运等，2011），本研究考察时间、温度、初始pH等外界条件对菌株降解单宁的影响，以提高菌株对单宁的降解能力。

1 材料与方法

1.1 菌株 黑曲霉SL-5（由中国科学院微生物研究所鉴定），由本实验室筛选。

1.2 培养基 察氏培养基，NaNO33.0 g/L，K2HPO41.0 g/L，KCl 0.5 g/L，MgSO40.5 g/L，FeSO40.01 g/L，蔗糖 30 g/L，121 ℃灭菌 20 min。

发酵培养基，在无糖察氏液体培养基中加入0.5%的水解单宁（国药集团化学试剂有限公司），用于单宁降解率的测定。

1.3 培养时间对降解率的影响 250 mL三角瓶中加入50 mL发酵培养基，按5%接种量接种菌悬液，初始pH 7.0、28℃、180 r/min条件下，分别摇床培养 1、2、3、4、5 d，测定单宁降解率，考察培养时间对降解率的影响。

1.4 培养温度对降解率的影响 250 mL三角瓶中装入50 mL发酵培养基，按5%接种量接种菌悬液，初始pH 7.0、180 r/min条件下，分别在20、25、28、30、32、35 ℃温度下培养 3 d， 测定单宁降解率，考察培养温度对降解率的影响。

1.5 初始pH值对降解率的影响 250 mL三角瓶中装入50 mL发酵培养基，按5%接种量接种菌悬液，在28℃、180 r/min条件下，分别在初始pH 6、6.5、7、7.5、8 时培养 3 d， 测定单宁降解率，考察初始pH对降解率的影响。

1.6 摇瓶装液量对降解率的影响 在初始pH 7.0、28℃、180 r/min条件下，250 mL三角瓶中分别装入 12.5、25、50、75、100 mL 发酵培养基，按 5%接种量接种菌悬液，培养3 d，测定单宁降解率，考察摇瓶装液量对降解率的影响。

1.7 单宁浓度对降解率的影响 250 mL三角瓶中装入50 mL察氏培养基，分别加入0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%水解单宁，按5%接种量接种菌悬液，在初始pH 7.0、28℃、180 r/min条件下培养3 d，测定单宁降解率，考察单宁浓度对降解率的影响。

1.8 单宁测定方法 采用络合法测定单宁含量（杨文云等，1999）。量取30 mL培养液 [液温（20±1）℃ ]移入500 mL烧杯中，加水至约300 mL，置（35±2℃）水浴中预热，精确量取1 mol/L乙酸锌溶液20 mL置于500 mL容量瓶中，加入14 mL氨水，摇匀使白色沉淀溶解，缓慢移入上述溶液，边移入边振荡，移毕继续振摇1 min后置于原水浴保温30 min（间歇振摇数次），待反应完毕，定容。取反应溶液于离心机上以3000 r/min离心5 min，再取上层清液于离心机上以3500 r/min离心10 min后，精确量取50 mL上层清液，加300 mL蒸馏水、25 mL氯化铵—氨水缓冲液 （pH=10）和1 mL铬黑T指示剂，以0.05 mol/L乙二胺四乙酸二钠滴定至溶液由酒红色变为暗蓝色，并用空白校正。1 mL乙酸锌（1 mol/L）消耗单宁0.1446 g（杨丽平和杨永红，2004）。络合法测定单宁的含量按下式计算：

单宁含量/%=（20 ×CZn-10 ×CEDTA×V） ×0.1446；

式中，CZn是指乙酸锌标准溶液浓度，mol/L；CEDTA是指 EDTA·2Na标准溶液浓度，mol/L；V 是指校正后的EDTA·2Na标准溶液滴定消耗量，mL。

通过发酵前后单宁量的变化，计算降解率。

1.9 数据分析 采用SPSS 13.0软件进行数据分析，数据以平均值±SEM表示。

2 结果与分析

2.1 培养时间对降解率的影响 由图1可以看出，培养第1天和第2天时，降解率增加速度比较缓慢，在第2天至第3天时降解率迅速增加，并在第3天达到最大值。随着培养时间的延长至第4天和第5天，降解率变化幅度较小。

2.2 培养温度对降解率的影响 由图2可知，黑曲霉在28～30℃时对单宁的降解率达到最高值，当温度低于28℃，或者高于30℃降解率开始降低。

图1 时间对单宁降解率的影响

图2 温度对单宁降解率的影响

2.3 初始pH值对降解率的影响 从图3可以看出，当初始发酵液的pH值为6.5时，黑曲霉对单宁的降解率达到最高值。pH值偏高或偏低均不利于微生物的生长，从而降低单宁的降解率。

2.4 摇瓶装液量对降解率的影响 从图4可以看出，菌株在250 mL三角瓶中培养时，当装液量为50～75 mL时，单宁的降解率最高。

图3 初始pH值对单宁降解率的影响

图4 摇瓶装液量对单宁降解率的影响

2.5 单宁浓度对降解率的影响 由图5可知，培养液中单宁浓度较低时，单宁的降解率最高，随着单宁浓度的增加，降解率逐步降低。

图5 单宁浓度对单宁降解率的影响

3 讨论

在前期的研究当中，筛选出一株具有单宁的降解能力的黑曲霉菌株（乔家运，2011），因此，本研究通过优化发酵条件，以提高黑曲霉对单宁的降解能力。

在菌体早期生长阶段，由于菌体生长速度也比较慢，因此降解率增加速度较慢，之后经历快速生长期，在第3天已达到平台阶段，之后变化较小。可以认为，由于培养较长时间后培养基中养分逐步减少，同时菌体代谢产物的反馈抑制也可能产生了一定的作用，造成菌体生长趋于停止（阮祥稳和任平，2009）。

由于微生物对单宁的降解是其分泌单宁酶的作用，微生物生长过程中分泌酶均有最适宜的温度和pH，微生物在不同温度和pH下的生长速度以及单宁酶的产量不同，因而单宁的降解率不同。

装液量与发酵液中溶氧量有关，供氧量是影响菌体生长的重要因素。过多的溶解氧会造成单宁的氧化，过少的溶解氧会影响菌体的生长繁殖，抑制菌体的生长代谢。

高浓度的单宁会对菌体的生长和单宁的生物降解产生抑制（Bhat等，1998），因此降低了菌体的生长和单宁酶的分泌，降低单宁降解率。

4 小结

研究表明，黑曲霉降解水解单宁的适宜条件为：28～30℃，培养液初始pH 7.0，250 mL三角瓶中装入50～75 mL培养液，180 r/min连续培养3 d。随着单宁浓度的提高，降解率逐步降低。

[1]乔家运，李平，陈龙宾，等.单宁降解菌的筛选及降解研究[J].饲料工业，2011，32（5）：28 ～ 29.

[2]阮祥稳，任平.黑曲霉降解石榴皮单宁培养条件的研究[J].西北林学院学报，2009，24（2）：101 ～ 104.

[3]杨丽平，杨永红.石榴皮的研究进展[J].云南中医中药杂志，2004，25（3）：45～47.

[4]杨文云，李志国，吴昊，等.络合法测定塔拉单宁含量的研究[J].西南林学院学报，1999，19（4）：249 ～ 252.

[5]Bhat T K，Singh B，Sharma O P.Microbial degradation of tannins-a current perspective[J].Biodegradation，1998，9：343 ～ 357.

[6]Frazier R A，Deaville E R，Green R J，et al.Interactions of tea tannins and condensed tannins with proteins[J].J Pharm Biomed Anal，2010，51：490 ～ 495.

[7]Getachew G，Pittroff W，Putnam D H，et al.The influence of addition of gallic acid，tannic acid，or quebracho tannins to alfalfa hay on in vitro rumen fermentation and microbial protein synthesis[J].Anim Feed Sci Technol，2008，140：444 ～ 461.

[8]Li M S，Yao K，He Q，et al.Biodegradation of gallotannins and ellagitannins[J].J Basic Microbiol，2006，46：68 ～ 84.