鳕鱼皮复合肽的制备工艺研究

黄 薇，邓尚贵，唐 艳，李淑芳，孔巧香

（浙江海洋学院食品与药学学院，浙江舟山 316000）

鳕鱼Gadous macrocephaius是海洋深水鱼，为底层冷水性群聚鱼类，在我国主要产于黄海和东海北部，是我国北方沿海出产的海洋经济鱼种之一，一直作为生产鱼片、鱼块及风味鱼糕等的原料[1]。我国鳕鱼年加工量（4～5）×105t[2]，在其生产过程中会产生大量下脚料鱼皮、鱼骨及附着鱼肉。其中鳕鱼皮占加工量的7%～8%[3]，目前的利用仍处于初级阶段，如仅仅将其加工为动物饲料等，产品附加值低。而鱼皮干物质中50%以上为胶原蛋白[4]，其生物效价较高，并含有大量人体需要的无机盐，如铁、钙、镁和磷等。

近年来研究发现，将鱼皮蛋白水解为易溶于水的小分子蛋白多肽或游离氨基酸，将更有利于人体消化与吸收。小分子多肽可以由肠道直接吸收，其吸收途径比氨基酸的吸收途径具有更大的输送量，且在消化吸收性能、营养和生理效果等方面具有更大的优越性[5]。可将水解鱼皮蛋白作为营养强化剂或食品添加剂添加到食品中，不仅可作为手术后病人、肾炎患者、糖尿病患者和高血压患者的疗效食品，还可作为水产品调味料。水解多肽产品还具有抗过敏性、降低胆固醇、降低血压、增强免疫等诸多生理功能，所以将海洋低值鱼及其下脚料加工成水解蛋白多肽无疑具有广阔的市场空间。

鱼类及其副产物的降解方法中，由于酶水解法条件温和，能在一定条件下进行定位水解分裂产生特定的肽，且氨基酸不会被破坏，构型也不发生变化，近年来多被采用。本文使用木瓜蛋白酶与风味酶组合成的复合酶对鳕鱼皮蛋白进行酶解，以水解度为指标，确定了最佳的酶解条件。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

鳕鱼皮，浙江海士德食品有限公司提供；风味酶（400 000 U/g）和木瓜蛋白酶（2 000 000 U/g），均购自南宁庞博生物工程有限公司；其他化学试剂均为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司。

1.2 主要仪器与设备

JJ-2组织捣碎匀浆机，金坛市精达仪器制造厂；数显恒温水浴锅HH-4，上海博讯实业有限公司；pH计（DECTA320A/C），瑞士梅特勒托利多公司；JJ-1精密增力电动搅拌器，国华电器有限公司；EYELA冷冻干燥机，上海爱朗仪器有限公司；超声波清洗机，上海新芝电子有限公司；DHG-9075A型电热恒温鼓风干燥箱，上海精宏实验设备有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 鳕鱼皮酶解工艺

将鳕鱼皮洗净沥干，剪碎，组织捣碎匀浆机捣碎，再加入由木瓜蛋白酶与风味酶按照一定的复合比混合而成的复合酶，在一定条件下水解数小时。水解完成后，将水解液的温度升高至90℃并持续加热15 min以使酶失活。冷却至室温后，在4 500 r/min的转速下离心20 min，取上清液为水解液并测定其水解度。

1.3.2 蛋白质水解度（DH）的测定[6]

DH(%)=已水解的肽键数/原料中总肽键数×100=[(B-C)/(A-C)]×100

A：原料中总氨基氮数；B：水解液中的氨基氮数；C：原料游离的氨基氮数

2 结果与分析

2.1 木瓜蛋白酶与风味酶复合比对酶解的影响

在料液比1:1，温度45℃，pH 7.0，酶解时间3 h的条件下，分别准确称取1 g鳕鱼皮，加入30 000 U/g的混合酶，以DH为指标，研究酶复合比对酶解的影响，结果如图1所示。

从图1可以看出，当木瓜蛋白酶与风味酶的比例为3:1时，水解度有最大值，高于或者低于该水平时，水解度均逐渐减小，因此，在后续试验中，均取复合比为3:1。

图1 复合比对酶解的影响Fig.1 Effect of compound ratio on degree of hydrulysis

2.2 料液比对酶解的影响

在木瓜蛋白酶与风味酶复合比取5:1，加酶量30 000 U/g，温度50℃，pH 7.0，酶解时间3 h的条件下，以DH为指标，研究料液比对酶解的影响，结果如图2所示。

从图2可以看出，当料液比在1:1～1:2之间时，水解度随着料液比的增加呈逐渐增加的趋势，而当料液比继续增大时，水解度的变化趋于平缓。这是由于当料液比较低时，底物浓度低，流动性好，与酶的结合较充分，水解度越来越大。但当料液比继续增大，底物的流动性越来越差，与酶的结合达到饱和，水解度变化也趋于平缓。因此，确定酶解的最佳料液比范围为1:1～1:3。

图2 料液比对酶解的影响Fig.2 Effect of material-to-liquid ratio on degree of hydrulysis

2.3 pH对酶解的影响

在木瓜蛋白酶与风味酶复合比取5:1，加酶量30 000 U/g，料液比1:2，温度50℃，酶解时间3 h的条件下，以DH为指标，研究pH对酶解的影响，结果如图3所示。

pH是影响酶解反应的重要因素之一，酶分子以及底物蛋白质分子的构想和解离状态会随pH的变化而变化，从而影响酶与底物蛋白的结合。从图3可以看出，当pH小于6.5时，水解度随着pH的增大而逐渐增加，当pH大于6.5时，水解度随pH的增加而逐渐降低。因此，确定酶解的最佳 pH 范围在 5.5～6.5。

图3 pH对酶解的影响Fig.3 Effect of pH value on degree of hydrulysis

2.4 温度对酶解的影响

在木瓜蛋白酶与风味酶复合比取5:1，加酶量30 000 U/g，料液比1:2，pH 6.0，酶解时间3 h的条件下，以DH为指标，研究温度对酶解的影响，结果如图4所示。

从图4可以看出，当温度小于45℃时，随着温度的升高，整个体系的内能不断增大，酶与底物蛋白的接触机会增大，速度加快，水解度呈显著上升的趋势。而当温度高于45℃时，水解度随着温度的增加而逐渐降低，这是因为温度的升高使酶发生了变性，水解效率降低。由此确定酶解的最佳温度范围在40～50℃。

图4 温度对酶解的影响Fig.4 Effect of hydrolysis temperature on degree of hydrulysis

2.5 加酶量对酶解的影响

在木瓜蛋白酶与风味酶复合比取5:1，料液比1:2，pH 6.0，温度45℃，酶解时间3 h的条件下，以DH为指标，研究加酶量对酶解的影响，结果如图5所示。

从图5可以看出，当加酶量在10 000～30 000 U/g时，水解度随着加酶量的增加而显著升高，由于在一定时间里，随着酶的增加，酶与肽键的接触率增加，蛋白质不断被水解，肽键数不断增加。而当加酶量大于30 000 U/g时，水解度虽然也随着加酶量量的增加而有所增大，但是变化趋势较缓慢，一方面是由于酶不能被底物饱和，过剩的酶不能与底物发生作用，另一方面由于酶浓度太大，产生了自溶，导致酶解作用减弱。因此，确定酶解的最佳加酶量范围为30 000～50 000 U/g。

图5 加酶量对酶解的影响Fig.5 Effect of enzyme dose on degree of hydrulysis

2.6 正交试验

在单因素试验的基础上，以蛋白质水解度为指标，采用正交试验法继续研究了加酶量、pH值、酶解温度和料液比等重要因子对酶解效果的影响，以确定最佳酶解条件。因素水平见表1，正交试验结果见表2。

表1 复合酶的因素及水平表Tab.1 Factors and levels in quadrature orthogonal design

表2 复合酶水解鳕鱼皮蛋白质最适条件的确定Tab.2 The optimum experimental conditions of hydrulysis using compound enzyme

从表2可以看出，由木瓜蛋白酶与风味酶组成的复合酶对鳕鱼皮蛋白水解度影响的各因素主次关系为：A＞C＞D＞B，即加酶量对DH的影响最大，温度的影响次之，而料液比的影响最小。复合酶水解的最佳组合为A2B3C2D2，即加酶量40 000 U/g，温度 45 ℃，pH 6.0，料液比 1:2.5。

2.7 最佳酶解条件下水解时间对酶解的影响（图6）

从图6可以看出，在2～3.5 h之间，DH显著增加，3.5 h之后DH的变化缓慢，可能是因为在酶解刚开始的一段时间里，底物浓度与酶活力都较高，产物的抑制小，有利于酶解的传质过程，水解度显著增加，而3.5 h之后，随着酶解时间的延长，由于酶的专一性，可酶解的肽键逐渐减少，酶活力逐渐降低，游离肽对产物的抑制增加，水解度变化缓慢。综合考虑，确定酶解的最佳时间为4 h，此时的水解度可达 22.45%。

图6 酶解时间对酶解的影响Fig.6 Effect of hydrolysis time on degree of hydrulysis

3 结论

利用木瓜蛋白酶与风味酶组合成的复合酶对鳕鱼皮蛋白进行酶解，通过单因素试验以及正交试验，确定了最佳的酶解条件为：木瓜蛋白酶与风味酶的复合比为3:1，加酶量为40 000 U/g，温度为45℃，pH 6.0，料液比为 1:2.5，酶解 4 h，此时有最大水解度，可达 22.45%。

[1]王海英,宋永相,孙 谧,等.酶解鳕鱼皮制备血管紧张素转换酶制剂ACEI的研究[J].现代食品科技,2008,24（10）：987-988

[2]孙丽平,汪东风,张 莉,等.利用鳕鱼皮蛋白制备热反应型肉香调味基料的研究 [J].中国海洋大学学报,2009,39（2）：249-250.

[3]陈 丽,李八方,赵 雪,等.可食性狭鳕鱼皮明胶-壳聚糖复合膜的制备与性质[J].水产学报,2009,33（4）：685-686.

[4]林 琳.鱼皮胶原蛋白的制备及胶原蛋白多肽活性的研究[D].青岛:中国海洋大学,2006.

[5]YAMAZAKI K,TAKAS S,HARA H.Process for producing a low-molecular weight peptide composition and nutrient agent containingthe same Unite state patent 4452888[P].1984-06

[6]赵新淮,冯志彪.蛋白质水解物水解度的测定[J].食品科学,1994(11)：66-67.