猪细小病毒感染Marc-145细胞后对其分泌白细胞介素18转录时相的影响

党玉丽，哈斯通拉嘎，耿静微，王瑞宁，郭东辉，胡清林，魏战勇

(1.河南农业大学理学院，河南 郑州 450002;2.郑州牧业工程高等专科学校，河南 郑州 450011;3.河南农业大学牧医工程学院，河南 郑州 450002)

猪细小病毒(Porcine parvovirus，PPV)是引起妊娠母猪繁殖障碍的主要病原体之一.初产妊娠母猪感染后，经胎盘侵袭胚胎或胎儿，引起母猪流产、胚胎死亡、胎儿畸形及木乃伊化，致使母猪不孕或反复发情，同时还可引起仔猪的皮炎和腹泻［1］.猪细小病毒在猪群中检出率甚高，在猪群中的血清抗体阳性率达50% ～80%［2］.炎性细胞因子特别是白细胞介素具有介导天然免疫、调节淋巴细胞活化、生长和分化等免疫调节作用，是目前临床医学、免疫学和肿瘤学等领域的研究热点之一［3］.体内白细胞介素的表达发生异常，与机体免疫功能低下或发生病理损伤有关［4］.对炎性细胞因子特别是白细胞介素表达量的准确测定、反应机体的免疫状态、揭示疾病的发病机理、探索感染后机体的免疫应答规律均具有重要意义.常用的检测白细胞介素(Interleukin，IL)等细胞因子的方法(放射免疫法，ELISA，MTT法)不同程度上存在灵敏度不高、污染环境、费时、操作复杂和难以准确定量等缺点.实时荧光定量PCR技术以其准确、快速、定量的优点，迅速被应用于功能基因组、分子医学、病毒学、微生物学及生物工艺学等领域［5］，也是测定在细胞因子的表达研究方面主要手段之一.本试验利用SYBR Green I实时定量PCR检测方法，分不同时间点定量检测PPV感染Marc-145后IL-18 mRNA的表达水平.为研究IL-18的抗细小病毒机制提供理论参考和试验依据，并为预防控制PPV提供理论支持.

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病毒 猪细小病毒7909标准毒株(PPV-7909)购自中国兽药监察所，病毒滴度为 106.1TCID50·mL－1.

1.1.2 细胞Marc-145 细胞为河南省动物性食品安全重点实验室保存，细胞生长于含10%新生犊牛血清的 DMEM培养基中，于体积分数为5%CO2，37℃培养箱中培养.

1.1.3 试剂 Protein K(Promega公司);DMEM培养基(GIBCOBR公司);Trypsin(Invitrogen);胎牛血清(Hyclone公司);E.Z.N.A Total RNA KitⅠ(OMEGA);SYBR®Premix Ex TaqTMⅡ(TaKaRa);RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit(MBI Fermentas);其它常规试剂均为分析纯.

1.1.4 仪器 Mastercycle ep realplex Real-Time PCR仪(Eppendorf公司);台式高速低温离心机(德国 Sigma公司);PTC－200型 PCR仪(M J Research公司);紫外凝胶成像系统(美国SIM公司);小型台式离心机(德国Sigma公司).

1.2 病毒感染

将Marc-145细胞用胰酶溶液分散后，培养于6孔培养板(2×105个·孔－1)，培养细胞丰度达80%后，用PBS洗2次，将PPV接种于Marc-145细胞，吸附60 min，每隔15 min轻轻晃动1次，洗去未吸附的病毒，添加含有体积分数为2%胎牛血清的DMEM维持液.

1.3 细胞的收集

将病毒感染后 1，3，24，48 h的细胞分别用PBS洗2次，添加0.25%胰酶消化细胞，1 000×g离心10 min收集Marc-145细胞，保存于－80℃备用.

1.4 DNA及RNA的提取和反转录

按蛋白酶K法提取病毒DNA，参照E.Z.N.A Total RNA KitⅠ说明书提取细胞总RNA，具体方法和步骤参照文献［6］进行，以提取的总RNA为模板进行反转录，反转录合成的cDNA及提取的DNA作为荧光定量PCR模板.

1.5 引物和相对定量PCR

引物的设计使用Primer Premier 5.0软件，参照GenBank公布序列进行(表1).荧光定量PCR反应体系为 20 μL.其中，SYBR Premix Ex Taq 10 μL，上、下游引物各 0.4 μL，cDNA 600 ng.反应条件为:95℃，1 min;95℃，10 s;57℃，15 s;72℃，15 s，共进行40个循环，循环结束后升温至95℃，15 s，再降至60℃，15 s，开始从60℃递增至95℃，20 min，采集荧光信号得出扩增产物的溶解曲线，于95℃，15 s结束反应.

表1 Real-time PCR引物及其反应条件Table 1 Primers and conditions used for Real-time PCR assays

1.6 数据处理

在实时定量PCR中，Ct值是反映模板中目标基因含量的重要指标，通过样品和标准曲线Ct值比较，可以准确计算出RNA含量.另外，将目标基因与持家基因β-actin比较，消除由于收集细胞、反转录和加样中操作误差.将0 h未接种病毒的细胞因子的表达量设为1倍，使用Mastercycle ep realplex Real-Time PCR软件分析各基因相对于0 h的表达量变化水平.

2 结果与分析

2.1 PPV DNA水平测定

Marc-145 单层细胞感染 PPV 后，在1，3，24，48 h分别收集细胞，提取DNA，做荧光定量PCR，与β-actin进行比较分析，并将病毒感染1 h时病毒DNA含量定义为1倍，得出不同时间病毒DNA在细胞的增殖倍数(图1).

图1 PPV在Marc-145细胞中增殖规律Fig.1 The replication of PPV in Marc-145 cell

由图1可知，病毒感染后1 h就可以检测到病毒DNA，但病毒量相对较低;随后开始逐步上升，在感染后24 h病毒开始大量迅速增殖，48 h达到最高峰，从感染后24 h的13倍增殖到170倍.

2.2 细胞因子的测定

Marc-145单层细胞在感染 PPV 后 1，3，24，48 h分别收集细胞，提取RNA，反转录获得cDNA，做荧光定量PCR，并与β-actin进行比较分析，并以病毒感染0 h时mRNA含量定义为1倍，得出不同时间细胞因子RNA在细胞的增殖倍数(图2).

图2 白细胞介素18的转录时相Fig.2 The transcriptional profiles of interleukin-18

由图2可知，IL-18的表达量在1 h无明显变化，3，24 h增加，48 h轻微下降低于细胞对照水平.

3 讨论

1)实时荧光定量PCR技术不仅实现了PCR从定性到定量检测的飞跃，而且所有反应均在同一溶液中进行，不需任何后处理过程，具有特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高、能实现多重反应、定量结果具实时性和准确性等特点［7］.目前在不同的研究领域得到广泛的应用.PPV可以在ST，PK-15，Marc-45等多种细胞中增殖并引起细胞病变.本研究发现在PPV感染Marc-145细胞后1 h能检测到病毒，24 h后开始大量增殖，在感染后48 h达最高峰，达到170倍，这可能是由于病毒大量增殖，释放所致.

2)IL-18是一种高活性、多功能的生物活性糖蛋白，不仅可刺激Thl细胞高水平诱生IFN-γ，GMCSF，IL-2等细胞因子，而且可以直接激活IFN-γ的启动子，其诱导IFN-γ产生的能力比IL-12还强很多，促进免疫细胞表达FasL，增强FasL介导的细胞毒作用，促进T细胞的增殖，显著增强Thl细胞和NK细胞的细胞毒作用等免疫调节功能［8］.此外，IL-18具有抗病毒、抗结核分支杆菌、抗真菌、抗肿瘤免疫、抗变态反应性疾病作用及前炎因子活性，提高机体的细胞免疫水平，达到预防和控制微生物感染、抑制肿瘤发生的目的［9］.本研究发现，PPV感染Marc-145细胞后IL-18的表达量在3，24 h增加，48 h轻微下调.LIU等［10］发现 IL-18在宿主防御系统对抗流感病毒感染试验中，IL-18参与抑制流感病毒复制，尤其是在感染早期阶段激活NK活性，并增强NK细胞的细胞毒作用.表明IL-18可能在Marc-145细胞防御和抵抗PPV感染过程中起重要作用，PPV感染Marc-14初期能够引起细胞炎性反应，而当病毒大量增殖后又能够抑制细胞炎性反应、抑制NK等免疫细胞活性.

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