复方阿莫西林纳米乳制剂的安全性评价

杨雪峰，姜金庆，孙红武，欧阳五庆

(1.河南科技学院动物科学学院，河南 新乡 453003;2.西北农林科技大学动物医学院，陕西 杨凌 712100;3.第三军医大学药学院，重庆 400038)

安全性评价是新药研发的必需组成部分，旨在保证临床用药的安全性.复方阿莫西林纳米乳(Amoxicillin and Levofloxacin Hydrochloride Nanoemulsion，AMX-LH-NE)是将传统抗菌药物阿莫西林(AMX)与盐酸左氧氟沙星(LH)配伍，以纳米乳为药物载体研制而成的一种新型纳米级复方制剂［1］.据报道，该制剂对奶牛乳房炎主要病原菌的联合抗菌活性强［2］，在兽医临床中有望用于奶牛乳房炎等细菌感染性疾病的防控.因此，为保证AMX-LH-NE在兽医临床中的安全应用，必须对其进行临床前安全性评价研究.本研究利用急性毒性试验、皮肤刺激性试验和细胞毒性试验，对AMXLH-NE进行了体内外安全性评价.

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要药品与试剂 AMX和LH原料药，购自西安市临泽科技有限公司;AMX-LH-NE和空白纳米乳，参照文献［1］制备;脱毛剂和PBS溶液，均为自制;DMEM/F12细胞培养基，Gibco Invitrogen Corporation生产;胎牛血清，杭州四季青生物工程材料有限公司生产;胰酶消化液，碧云天生物技术研究所生产;二甲基亚砜(DMSO)，Amresco公司生产;MTT检测试剂，碧云天生物技术研究所生产.

1.1.2 试验动物 昆明种小鼠160只，体质量18～22 g，雌雄各80只，由西北农林科技大学实验动物中心提供.小鼠每笼饲养5只，自由饮水，温度为(22±2)℃，相对湿度为40% ～70%.健康成年白色家兔48只，体质量2～3 kg，由西北农林科技大学实验动物中心提供，常规饲养管理，自由饮水.

1.1.3 受试细胞 乳腺上皮细胞由西北农林科技大学细胞生物学实验室提供.

1.1.4 主要仪器 SW－CJ－1F型超净工作台(苏州净化设备有限公司);Olympus CKX41倒置显微镜(日本Olympus公司);Model550酶标仪(美国BIO-RAD公司);MCO－15AC型 CO2培养箱(日本Sanyo公司).

1.2 方法

1.2.1 急性毒性试验 (1)预试验.试验方法参照文献［3］.找出引起小鼠100%和0死亡的剂量.取20只小鼠，随机分为2组，每组10只，雌雄各5 只.按0.020 mL·g－1的剂量，1 组灌胃 AMXLH-NE，另1组灌胃空白纳米乳.灌胃前12 h禁食、不禁水，灌胃后常规饲养，并观察小鼠3 d内死亡情况.结果2组小鼠均无死亡，无法测出其半数致死量(LD50)，因此采用测定小鼠最大耐受量来测定受试药物对小鼠的急性毒性作用.(2)最大耐受量试验参照文献［4］的方法.取小白鼠140只，随机分为7组:对照组、空白纳米乳组(3组)和AMX-LH-NE组(3组)，每组20只，雌雄各10只.将空白纳米乳和 AMX-LH-NE分别按 0.025，0.030，0.035 mL·g－13 个不同灌胃剂量组口服灌胃给药 1 d，对照组按 0.035 mL·g－1灌蒸馏水，灌胃前禁食12 h，不禁水，灌胃后常规饲养.连续观察7 d内动物的中毒反应及有无死亡.以死亡为主要指标，如有死亡，则以刚不出现死亡组为准，此时的用药量即为小鼠的最大耐受量.试验结束时称小鼠的体重，并参照文献［5］计算灌胃AMX-LH-NE组小鼠的最大耐受量倍数.

1.2.2 皮肤刺激性试验 皮肤刺激性试验参照文献［6］的方法.(1)试验动物的处理.将健康家兔48只，随机分为生理盐水组、空白纳米乳组和AMX-LH-NE组，每组16只，完整皮肤和破损皮肤各8只，雌雄各4只.于给药前24 h，在家兔脊柱两侧脱毛，面积为10 cm×5 cm，以无红斑、水肿及破损为佳.每组用4只家兔(雌雄各2只)进行完整皮肤刺激性试验，另4只(雌雄各2只)建立损伤皮肤模型，方法是在去毛处用无菌针头划“井”字，以划破表皮渗血为宜，并控制左右两侧皮肤的破损程度基本保持一致.(2)单次给药(或急性)皮肤刺激性试验.采用左右侧自身对比，左侧脱毛区按0.5 mL·只－1涂生理盐水、空白纳米乳或 AMXLH-NE，右侧不涂抹作对照，并用无刺激纱布和胶布固定，每只家兔单笼饲养.给药24 h后，用温水清洗涂抹部位，去除残留药物，观察记录去除药物后1，24，48，72 h时涂抹部位有无红斑和水肿反应.涂抹部位参照文献［7］进行评分和评价刺激强度.(3)多次给药皮肤刺激性试验.每天定时涂抹给药1次，连续涂抹7 d.在每次去除药物后1 h，观察记录涂抹部位有无红斑和水肿反应，其他均同单次给药皮肤刺激性试验.

1.2.3 AMX-LH-NE对乳腺上皮细胞的毒性试验参照 GB/T 16886.5—2003/ISO 10993—5∶1999，利用四唑盐比色试验(MTT比色法)进行.(1)细胞分组.将96孔板分为空白对照组(调零孔)、正常对照组、DMSO阳性对照组、AMX-LH-NE组、空白纳米乳组、AMX-LH水溶液组、阿莫西林(AMX)组和左氧氟沙星(LH)组.每组设4个复孔.(2)加入药物.以每孔1×104个·mL－1接种乳腺上皮细胞，培养48 h时，弃净旧培养液，空白对照组和正常对照组分别更换新鲜培养液100 μL，DMSO组中加入100 μL DMSO;其余各组分别加入用新鲜培养液配制的受试药物100 μL，并使各种药物的终质量浓度分别为 10，50，100，150，200 mg·L－1.每种药物质量浓度设4个复孔，每板均设空白对照孔.加入受试药物后继续培养细胞.(3)呈色.细胞与受试药物孵育24 h，终止培养，在倒置显微镜下观察并拍照，然后每孔加入MTT溶液(5 g·L－1)20 μL，37 ℃继续孵育4 h，终止培养，小心弃净孔内培养上清液.每孔加入150 μL DMSO，振荡10 min，使甲臜充分溶解.(4)比色.在酶联免疫检测仪上，选择波长490 nm，测定各孔吸光度值(OD值).(5)细胞毒性评价.根据测定的吸光度值，计算细胞的相对增殖度(Relative growth rate，RGR).然后以正常对照组的RGR作为100%的细胞增殖度，根据细胞毒性分级［8］，评价各受试药物对乳腺上皮细胞的毒性.

2 结果与分析

2.1 急性毒性试验结果

灌药后观察各组小鼠发现，对照组小鼠在灌胃后15 min内呼吸急促，在30 min内精神萎靡，活动减少，蜷缩成堆;灌药各组小鼠在灌胃后20 min内呼吸急促，在1 h内精神萎靡，活动减少，蜷缩成堆，其中AMX-LH-NE各组小鼠在灌胃后第2天出现粪便黏稠不成形，且随灌胃体积的增大而加重，但至第3天时均恢复正常.之后4 d内各组小鼠行为活动正常，最后均无死亡.

试验结束时，最大耐受量试验对最大灌胃剂量组小鼠体重的影响结果见表1.由表1可知，与对照组相比，空白纳米乳组和AMX-LH-NE组对小鼠平均体重的影响均差异不显著(P＞0.05).处死小鼠，解剖后肉眼观察心、肝、肺、胃、肾、胰腺、肠、脑等器官均未发现异常.结果表明，小鼠的最大耐受量为 0.035 mL·g－1，最大耐受量倍数为426倍，即相当于奶牛(按体质量750 kg计算)临床日用药量的426倍，提示AMX-LH-NE安全、无毒.

表1 0.035 mL·g－1灌胃剂量时药物对小鼠体重的影响Table 1 Effect of different drug on body weight of mice at the intragastric administration dose of 0.035 mL·g－1

2.2 皮肤刺激性试验结果

AMX-LH-NE对家兔单次给药皮肤刺激性试验结果见表2.AMX-LH-NE和空白纳米乳对完整皮肤，均未引起红斑和水肿刺激反应，各观察时间点的刺激分值均为0，属无刺激性;AMX-LH-NE和空白纳米乳对破损皮肤，在观察时间点1 h时，刺激分值均为0.5，属温和的轻度刺激性，1 h后的刺激分值均小于0.5，属无刺激性.

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AMX-LH-NE对家兔多次给药皮肤刺激性试验结果见表3和表4.由表3可知，AMX-LH-NE和空白纳米乳对完整皮肤多次给药，均未引起红斑和水肿刺激反应，每天每只动物的平均刺激分值均为0，属无刺激性.由表4可知，AMX-LH-NE和空白纳米乳对破损皮肤每天多次给药时，均未引起水肿刺激反应，在前4 d每天每只动物的平均刺激分值0.50～0.63，属轻度刺激性;5 d后其平均刺激分值均小于0.5，属无刺激性;试验结束时，每天每只动物平均刺激分值均为0.32，属无刺激性.

2.3 AMX-LH-NE对乳腺上皮细胞的毒性

2.3.1 AMX-LH-NE对乳腺上皮细胞形态的影响正常生长的乳腺上皮细胞均牢固地贴附于培养孔底，处于旺盛的分裂期，可见大量分裂细胞，细胞数目增多(图1－A).与正常对照组细胞相比，DMSO阳性对照组细胞数量减少，细胞圆缩，死亡的圆形细胞漂浮，且数量较多，表明DMSO对细胞有较大的毒性(图1－B).在各试验组中，当药物质量浓度为200 mg·L－1时，AMX-LH-NE与其他各试验药物情况相同，对乳腺上皮细胞的形态和生长产生明显影响，表现为细胞变得不规则，生长受抑制，数量减少，死亡细胞增多;当药物浓度均为150 mg·L－1时，AMX-LH-NE(图1 －C)、空白纳米乳(图1－D)、AMX-LH(图 1－E)、AMX(图 1－F)、LH(图1－G)作用细胞24 h后，除细胞的生长速度较正常细胞稍慢外，形态无明显变化，对乳腺上皮细胞的生长无显著影响;当药物质量浓度在10～100 mg·L－1时，各药物对乳腺上皮细胞的形态和生长速度无影响.

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2.3.2 AMX-LH-NE对乳腺上皮细胞的毒性结果AMX-LH-NE对乳腺上皮细胞的毒性结果见表5.由表5可知，DMSO对乳腺上皮细胞的毒性大，为4级，不合格;当AMX-LH-NE质量浓度为200 mg·L－1时，对乳腺上皮细胞的毒性分级为3级，与AMX-LH相同，其余各试验药物的毒性分级均为2级，结合细胞形态分析，综合评价均为不合格;当AMX-LH-NE质量浓度在10～150 mg·L－1时，对乳腺上皮细胞的毒性分级为0或1级，与空白纳米乳、AMX-LH，AMX，LH情况相同，说明在此剂量范围内，各试验药物对乳腺上皮细胞的生长和形态无不良影响，无毒性作用，合格，使用安全.

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3 结论与讨论

1)急性毒性试验是安全性评价的重要内容.在本试验中，经口灌胃AMX-LH-NE的各组小鼠行为活动、呼吸、粪便的异常情况持续时间较对照组长，原因可能主要是由于满负荷灌胃操作刺激的影响;各灌胃剂量组的小鼠在灌胃后第2天均出现不同程度的粪便黏稠不成形现象，且随灌胃容积的增加而加重，空白纳米乳各组未出现此现象，但腹泻持续时间均较短，至第3天均已恢复正常.结果表明，AMX-LH-NE毒性低，小鼠的最大耐受量倍数为426倍.本研究进行的皮肤刺激性试验结果表明，无论是单次给药还是多次给药，AMX-LH-NE对完整皮肤和破损皮肤均无明显刺激性.

2)本试验利用MTT比色法研究了AMX-LHNE对乳腺上皮细胞的毒性影响.结果表明，当AMX-LH-NE质量浓度在 10～150 mg·L－1时，对乳腺上皮细胞的活性和功能状态无不良影响;当AMX-LH-NE质量浓度为200 mg·L－1时，则对乳腺上皮细胞有一定的毒性作用.由于150 mg·L－1AMX-LH-NE远远大于AMX-LH-NE对各种奶牛乳房炎主要病原菌的最小抑菌浓度(MIC)［2］.因此，当AMX-LH-NE质量浓度≤150 mg·L－1时对乳腺上皮细胞的生物安全性较好.试验结果表明，AMXLH-NE安全，无毒，刺激性小，符合临床用药的安全性要求.

［1］杨雪峰，欧阳五庆，曹发昊，等.复方阿莫西林纳米乳的制备及其稳定性研究［J］.西北农林科技大学学报:自然科学版，2008，36(12):19－23.

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