蜡梅AFLP反应体系优化及引物筛选

赵明晓，冯志敏，胡 湛，赵振利，范国强

(1.河南农业大学，河南 郑州 450002;2.信阳农业高等专科学校，河南 信阳 464000;3.焦作市园林局，河南 焦作 454003)

AFLP(Amplified fragment length polymorphism)是一种DNA多态性分子标记技术.既有RFLP的可靠性，又有RAPD的方便性［1］.目前，在梅花、泡桐、苹果、白桦和板栗等［2～7］木本植物亲缘关系研究及遗传多样性［8］、图谱构建［9～11］、基因定位［12］、品种鉴定［13，14］、杂种优势预测和分子标记辅助选择育种［15］等方面得到广泛应用.蜡梅(Chimonanthus praecox)为中国特有的花卉植物，品种多，具有较高的观赏价值.近年来，研究人员对蜡梅SRAP［16］，RAPD［17］，ISSR［18］和 SSR［19］等技术体系进行了深入研究，在其AFLP技术体系方面虽然也有文献报道［20～22］，但存在体系不完善等问题，并且在目前所建立的体系中都没有进行引物筛选工作，给蜡梅分子生物学研究带来了很多困难.为深入开展蜡梅分子辅助育种和基因组等研究奠定基础，作者进行了蜡梅AFLP技术体系优化及引物筛选工作.

1 材料与方法

1.1 试验材料

材料为河南农业大学校区中心花坛栽植4 a的素心蜡梅(Chimonanthus praecox)健康植株当年生枝条叶片.

1.2 试验方法

1.2.1 蜡梅基因组DNA提取 蜡梅基因组DNA的提取参照张延召等［23］的方法，利用紫外分光光度计和质量分数为1%的琼脂糖凝胶电泳检测其质量.

1.2.2 蜡梅AFLP体系优化

1.2.2.1 酶切体系 参照曹喜兵等［24］的方法.总体积为 20 μL，包括 600 ng 模板 DNA，0.2 μL 100 × BSA，3 U Pst I，3 U Mse I和2.0 μL 10 × NEB Buffer，加超纯水至20 μL.混匀后在PCR仪上37℃分别酶切 1，2，3，4，5，6 h 后，80 ℃失活20 min.然后，分别取其产物5 μL在质量分数为1%的琼脂糖凝胶上电泳(4～5 V·cm－1).根据电泳结果筛选出最佳酶切时间.

1.2.2.2 连接体系 接头(由北京奥科生物技术有限责任公司合成)的制备:Pst I接头(10 μmol·L－1):分 别 吸 取 2 μL 的 Pst I 正 (5’-CTCGTAGACTGCGTACATGCA-3’)、反 (5’-TGTACGCAGTCTAC-3’)接头，然后加入36 μL的双蒸水混合至 40 μL;Mse I接头(100 μmol·L－1):分别吸取20 μL 的 Mse I正(5’-GACGATGAGTCCTGAG-3’)、反(5’-TACTCAGGACTCAT-3’)接头，然后混匀.最后把接头放在离心机上点离拿出放入4℃冰箱20 min后，放入PCR仪上60℃制接头.连接体系总体系20 μL，该体系包括15 μL上述酶切产物，0.25 μmol·L－1Pst I 接头，2.5 μmol·L－1Mse I接头，不同量(1.0，2.0，3.0，4.0 U)的 T4连接酶及 1 μL 10 × T4Buffer，加去离子水至 20 μL，然后于PCR扩增仪上在22℃条件下分别连接8，10，12，14，16，18 h，根据连接结果筛选出最佳连接时间.

1.2.2.3 预扩增体系 (1)连接产物用量优化.在各体系中分别加入 5 μL 稀释为 1，5，10，15，20，25 倍的连接产物，2.0 mmol·L－1的 Mg2+，2 U Taq酶，0.5 μmol·L－1P00，0.5 μmol·L－1M00 和 300 μmol·L－1dNTP，然后分别用去离子水补至 20 μL.(2)Mg2+用量优化.在各体系中分别加入0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 mmol·L－1的 Mg2+，5 μL 稀释10 倍的连接产物，2.0 mmol·L－1的 Mg2+，2 U Taq 酶，0.5 μmol·L－1P00，0.5 μmol·L－1M00 和300 μmol·L－1dNTP，分别用去离子水补至20 μL.(3)Taq酶用量优化.在各体系中分别加入1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 U 的 Taq 酶，5 μL 稀释 10 倍连接产物，2.0 mmol·L－1的 Mg2+，0.5 μmol·L－1P00，0.5 μmol·L－1M00 和 300 μmol·L－1dNTP，然后用去离子水补至20 μL.(4)dNTP浓度优化.在各体系中分别加入 100，200，300，400，500 μmol·L－1的 dNTP，5 μL 稀释10 倍的连接产物，2.0 mmol·L－1的 Mg2+，0.5 μmol·L－1P00，0.5 μmol·L－1M00和2U Taq酶，然后分别用去离子水补至20 μL.(5)引物浓度优化.在各体系中分别加入0.3，0.5，0.7，0.9，1.1 μmol·L－1预扩增引物 P00 和M00，稀释 10 倍连接产物 5μL，300 μmol·L－1dNTP，2.0 mmol·L－1的 Mg2+，2 U Taq 酶，用去离子水补至 20 μL.

1.2.2.4 选择性扩增体系 (1)预扩增产物用量优化.在各体系中分别加入 5 μL稀释5，10，15，20，25，30 倍的预扩增产物，0.5 μmol·L－1Pst I引物，0.5 μmol·L－1Mse I引物，2.0 mmol·L－1的Mg2+，300 μmol·L－1dNTP，2 U Taq 酶，加去离子水补至20 μL以进行选扩.(2)Mg2+用量优化.在各体系中分别加入 0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 mmol·L－1的 Mg2+，5 μL 稀释 10 倍的连接产物，2.0 mmol·L－1的 Mg2+，2 U Taq 酶，0.5 μmol·L－1Pst I引物，0.5 μmol·L－1Mse I 引物和 300 μmol·L－1dNTP，分别用去离子水补至 20 μL.(3)Taq 酶浓度优化.不同体系中分别加入 0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 U Taq 酶，5 μL 稀释 20 倍预扩增产物，0.5μmol·L－1Pst I和 Mse I引物(引物 9)，300 μmol·L－1dNTP，2.0 mmol·L－1的 Mg2+，加去离子水至20 μL.(4)dNTP浓度优化.在各体系中分别加入 100，200，300，400，500 μmol·L－1的 dNTP，5 μL 稀释 20 倍的预扩增产物，0.5 μmol·L－1Pst I和 Mse I引物(引物 9)，2 U Taq 酶，2.0 mmol·L－1的 Mg2+，加去离子水至 20 μL.(5)引物浓度优化.在不同的体系中分别加入 0.3，0.5，0.7，0.9，1.1 μmol·L－1Pst I和 Mse I引物及 5 μL 稀释20 倍预扩增产物，300 μmol·L－1dNTP，2 U Taq酶，2.0 mmol·L－1的 Mg2+，加去离子水补至20 μL.

1.2.3 引物筛选 利用优化后的蜡梅 AFLP体系，对64对引物(由奥科生物科技有限公司合成)组合进行筛选，筛选出适合蜡梅AFLP的选择性扩增引物.扩增程序、PCR选扩产物电泳、染色及凝胶扫描参照曹喜兵等［24］的方法，每泳道上样量为5 μL扩增产物.电泳结束后，选择谱带清晰和数目较多的引物作为AFLP反应的最佳引物.

2 结果与分析

2.1 蜡梅基因组DNA的质量

利用紫外分光光度计测定提取的蜡梅基因组DNA 的结果为:A230=0.078;A260=0.314;A280=0.174.A260/280，A260/230，A230/280的值分别为 1.805，4.026，0.448.说明提取的 DNA 无蛋白质、RNA 和酚类等小分子物质的污染.由DNA琼脂糖凝胶电泳结果表明(图1)，DNA片段达到5 000 bp以上，完全能满足AFLP分析要求.

图1 不同DNA量的琼脂糖凝胶电泳检测Fig.1 Electrophoresis validation of different concentrations genome DNA

2.2 蜡梅AFLP体系优化

2.2.1 酶切反应体系优化 为了得到更好的选扩结果，选择600 ng蜡梅进行不同时间酶切处理，其琼脂糖凝胶电泳结果表明(图2)，经 1，2，3，4，5，6 h酶切后，模板DNA皆能被完全切开，并且酶切片段几乎没差别，为保证蜡梅AFLP的后续试验结果，本试验选择2 h为该体系最佳的酶切时间.

图2 不同时间酶切DNA琼脂糖凝胶电泳Fig.2 Agarose gel electrophoresis of DNA with different enzyme cut times

2.2.2 连接反应体系优化 根据琼脂糖凝胶电泳结果表明(图3)，在反应体系中加入3.0 U的T4连接酶，0.25 μmol·L－1Pst I 和 2.5 μmol·L－1Mse I接头有利于蜡梅AFLP连接效果.在连接时间分别为8，10，12，14，16，18 h 条件下，随着连接时间的增加，预扩增产物量逐渐增加，为了试验最佳效果，本体系选择连接反应时间为12 h.

图3 不同时间连接DNA的琼脂糖凝胶电泳Fig.3 Agarose gel electrophoresis of DNA with different connection times

2.2.3 预扩增反应体系优化 不同连接产物稀释倍数结果表明(图4)，连接产物用量对预扩反应有较大影响.当连接产物分别稀释1，5，10倍时，扩增片段大小几乎相同;当连接产物稀释超过10倍时，扩增产物量明显降低，因此，本体系中蜡梅AFLP预扩增连接产物以稀释10倍为宜.由不同Mg2+浓度对预扩增反应结果(图5)可以看出，当Mg2+浓度为0.5 mmol·L－1时扩增出的产物量比较模糊，而 Mg2+浓度分别为 1.0，1.5，2.0，2.5 mmol·L－1时均能扩增清晰的谱带;但 2.0 mmol·L－1时谱带丰寓而且最清晰，扩增效果最好.因此，本试验从扩增的结果和成本考虑，确定Mg2+的最优浓度为2.0 mmol·L－1.从不同Taq酶量对预扩增反应结果表明(图6).当Taq酶量为1.0 U时，扩增产物量较少，但当Taq酶量从1.5 U增加到2.5 U时，扩增产物明显增多，并且随着酶量的继续增大，扩增产物增加几乎相同.因此，选择2.0 U作为蜡梅AFLP预扩增最佳Taq酶用量.由dNTP用量对预扩增反应可以看出(图7)，当dNTP浓度为 100 μmol·L－1时，预扩增产物量较低，当 dNTP浓度大于200 μmol·L－1时，预扩增产物量先升高后降低.这是dNTP与Taq酶对Mg2+竞争的结果，当 dNTP 浓度为 300 μmol·L－1时，预扩增产物量最大.因此，本试验选择300 μmol·L－1作为蜡梅预扩增最适dNTP浓度.由引物浓度对预扩增产物影响可以看出(图 8)，当其浓度为 0.3μmol·L－1时，预扩增产物量较低，当其浓度从 0.5μmol·L－1增加到1.1μmol·L－1时，扩增产物增加量几乎相同.从试验成本考虑，选择 0.5 μmol·L－1为该体系的最佳引物浓度.

图9 连接产物稀释倍数对选扩影响Fig.9 Effect of connection product diluted times on selective amplification

2.2.4 选择性扩增反应体系优化 不同预扩产物稀释倍数结果表明(图9)，预扩产物用量对选择性扩增反应有较大影响.当预扩产物分别稀释5，10，15，20倍时，扩增片段大小几乎相同;当预扩产物稀释超过20倍时，扩增产物量明显降低，考虑到节省样品，本体系中蜡梅AFLP选择性扩增预扩产物选择稀释20倍.由不同Mg2+浓度对选择性扩增反应结果可以看出(图10)，当 Mg2+浓度为0.5 mmol·L－1时扩增出的产物比较模糊，但随着Mg2+浓度的提高，扩增增出的产物量逐渐增加.因此，本试验从扩增的结果和成本考虑，确定Mg2+的最优浓度为2.0 mmol·L－1.不同Taq酶量对选择性扩增反应影响较大(图11).当Taq酶为0.5 U时，蜡梅AFLP扩增产物量较少，但当Taq酶增加到2 U时，扩增产物量明显增加.因此，选择2 U为Taq酶最适用量.dNTP浓度对于选择性扩增也有较明显的影响(图12).当dNTP浓度低于200 μmol·L－1时，选择性扩增产物量较低，当dNTP浓度大于200 μmol·L－1时，选择性扩增产物量先升高后降低.这是由于dNTP与Taq酶对Mg2+竞争的结果.当 dNTP 浓度为 300 μmol·L－1时，选扩产物量最大.因此，300 μmol·L－1为蜡梅 AFLP 选择性扩增体系中dNTP浓度的最适浓度.由不同引物浓度优化试验结果可以看出(图13)，引物浓度对选择性扩增反应有较大的影响.当引物浓度为0.3 μmol·L－1时，扩增量较少，随着引物浓度增大，扩增产量逐渐增多，扩增产量趋于稳定.因此，本体系中，选取引物适宜浓度为 0.5 μmol·L－1.

2.2.5 蜡梅AFLP选择性扩增引物筛选 用上述方法优化出的蜡梅体AFLP反应体系，对64对引物组合进行筛选，筛选出了96对引物(表1).结果表明(图14)，扩增产物电泳谱带清晰、分辨率高、重复性好、多态性强.因此，这些引物可用来开展蜡梅的分子生物学研究.

表1 蜡梅AFLP选择性扩增引物Table 1 Primer for AFLP of the selective amplification

图14 47对引物的AFLP选择性扩增图Fig.14 AFLP of selective amplification with 47 pairs of primers

3 结论与讨论

本研究通过对蜡梅AFLP体系优化，得出其最佳酶切体系(20 μL)为模板 DNA 600 ng，Pst I和Mse I各为3 U，在37℃下双酶切2 h;在20 μL最佳连接体系中酶切产物为15 μL，3 U T4连接酶，0.25 μmol·L－1Pst I接头，2.5 μmol·L－1Mse I接头，1 μL 10 × T4buffer，在 22 ℃ 下连接 10 h;在20 μL最佳预扩反应体系中稀释10倍的连接产5 μL，2.0 mmol·L－1Mg2+，2 U Taq 酶，300 μmol·L－1dNTP，0.5 μmol·L－1Pst I 和 Mse I引物 (P+AGA/M+ATC);在20 μL最佳选择性扩增反应体系中5 μL 稀释 20 倍的预扩增产物，2.0 mmol·L－1的 Mg2+，2U Taq 酶，300 μmol·L－1dNTP，0.5 μmol·L－1Pst I和 Mse I引物(P+AGA/M+ATC).此外，经引物筛选试验，从64对引物组合中，选出了96对引物可用于蜡梅 DNA的 AFLP分析.

蜡梅为木本植物，其叶片中含有大量的酚类、多糖等次生代谢物质，严重影响基因组DNA的得率和纯度及下游工作的进行［21］.本研究针对蜡梅叶片富含单宁和多糖等物质，利用张延召等［23］的方法提取其基因组DNA，可有效去除这些物质.该方法提取的DNA纯度高，片段大，用于AFLP反应中，能扩增出清晰的条带，为蜡梅的分子标记分析提供了基础.

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