利用酱油酿造废水生产微生物絮凝剂的研究

周喜新 ，杨 华 ，张 滨

（1.湖南农业大学，湖南 长沙 410128；2.长沙环境保护职业技术学院，湖南 长沙 410004）

微生物絮凝剂是一类由微生物产生的，可使液体中不易降解的固体悬浮颗粒凝聚、沉淀的特殊高分子代谢产物。该类絮凝剂是一种高效、廉价、无毒、无二次污染的水处理剂，可广泛应用于饮用水处理、废水处理、食品工业和发酵工业等领域[1-3]。但由于生产成本过高，生物絮凝剂在实际生产中尚未得到广泛推广应用。因而寻找廉价的培养基是生物絮凝剂产业化过程中亟待解决的问题[4-8]。

酱油作为人们日常生活中的调味品，满足了人们饮食需要。近年来由于酱油制造工业快速发展导致酱油生产废水排放量大增，带来了严重的环境污染问题。酱油废水浓度高、负荷变化大、色度大，属于难处理有机废水。但酱油废水中含有生物生长繁殖和代谢所需要的碳源、氮源及无机盐等营养物质，可用于微生物的培养[9-10]。试验以酱油废水为培养红平红球菌（Rhodococcus erythropolis）的替代培养基，通过优化培养条件发酵生产生物絮凝剂，以期为降低微生物絮凝剂的生产成本，解决酱油废水对环境的污染问题提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

红平红球菌（Rhodococcus erythropolis）（中国科学院微生物研究所）；酱油废水（湖南宁乡县加加酱油厂）。

1.2 方法

1.2.1 培养基 种子培养基：牛肉膏3 g/L，蛋白胨10 g/L，NaCl 3 g/L，pH 值 7.0。

废水培养基：取宁乡加加酱油厂废水稀释至不同浓度，添加不同量碳源，调pH值到不同值。

1.2.2 发酵液培养条件 250 mL三角烧瓶中装100 mL培养基，接种红平红球菌，分别在25、30、35℃，150 r/min振荡培养96 h。测定上清液中的絮凝活性。

1.2.3 絮凝剂的制备 在发酵液中添加 0.5%三氯醋酸+正丁醇（4∶1），静置 12 h，6 000 r/min 离心15 min，收集上清液。再向上清液中添加2倍体积的95%的乙醇，在4℃条件下静置24 h，虹吸上清液，收集沉淀物。沉淀物用70%的乙醇洗涤2次，得到生物絮凝剂粗制品。

1.2.4 絮凝率的测定 在装有5 g/L的100 mL高岭土悬浊液中，加入5 mL 1%的氯化钙溶液作为助凝剂，再加入2 mL的菌株发酵上清液，调pH值至7.5，混合搅拌5 min，静置10 min，用UV-754型分光光度计测定波长550 nm处的吸光度，同时以2 mL蒸馏水代替菌株发酵上清液作为对照，絮凝率计算公式：絮凝率=（A-B）/A×100% ，其中A为对照上清液550 nm处的吸光度，B为样品上清液550 nm处的吸光度。

2 结果与分析

2.1 不同碳源对发酵生产絮凝剂的影响

在酱油废水中添加质量浓度为10 g/L的不同碳源，分析其对絮凝率的影响，结果如图1所示。

图1 不同碳源对发酵生产絮凝剂影响

从图1可以看出，仅用酱油废水作为培养基，其絮凝率非常低，而添加少量碳源对絮凝剂产生的具有显著的影响。而且以加入葡萄糖的效果最为显著，其次是加入蔗糖。研究还发现，加入不同碳源的培养基生产的絮凝剂出现较高活性的时间不一样，用葡萄糖和蔗糖作为碳源的培养基较其它碳源的培养基快出现较高的絮凝活性。因此，发酵时可以加入适量的葡萄糖或蔗糖。但考虑到蔗糖价格远低于葡萄糖，生产时建议加入蔗糖作为碳源，以降低絮凝剂生产成本。

2.2 酱油废水发酵生产絮凝剂条件的优化

以培养红平红球菌的废水浓度，接种量，温度，pH值为4个因素进行正交试验，试验结果见表1。从表1中极差大小能看出，影响红平红球菌生长的因素从大到小依次为：pH值＞废水浓度＞接种量＞温度。其中pH值对絮凝率影响最大，pH值7.0为最优。其次影响的因素为废水浓度，当废水浓度为25%时，菌产絮凝剂的絮凝效果最好。其可能的原因是废水中存在某些对红平红球菌有害的物质，当其浓度过高时，抑制菌的生长；而当废水浓度过低时，其中的营养物质不足以完全满足菌产絮凝剂的需要，絮凝率也有所降低。接种量的极差较小，接种量分别为5%，10%和15%时对菌产絮凝剂影响不大。温度对絮凝剂的产生影响最小。考虑控温的成本，生产时可考虑采用自然温度。

表1 正交试验结果分析

2.3 红平红球菌发酵生产絮凝剂的生长曲线特征

将废水稀释4倍，并按10 g/L的浓度加入蔗糖，调pH值至7.0，30℃培养红平红球菌，间隔取发酵液测细胞浓度及絮凝活性。红平红球菌的生长曲线如图2所示。由图2可看出，24 h之前，菌体处于适应期，菌量无明显改变；24至36验h内，菌量有所增加，但速度很慢。36 h后红平红球菌经过适应期后进入了对数生长期，菌体生长迅速，细菌数目以几何数增加。废水培养基发酵60 h以后，红平红球菌生长进入了稳定期，菌的生长速率下降，细菌的生长速率与死亡速率达到一个动态平衡。当细胞进入生长期，絮凝剂开始大量生成；当细胞生长进入平衡期后，絮凝剂的生成基本停止。可见，在酱油废水培养基中红平红球菌絮凝剂生长曲线模式属于比较典型的生长偶联型[11-12]。

图2 红平红球菌产絮凝剂与细胞生长的关系

2.4 絮凝剂的产率及絮凝效果

将废水稀释4倍，并按10 g/L的浓度加入蔗糖，调pH值至7.0，30℃培养红平红球菌。60 h后发酵液制备絮凝剂，得率为1.68 g/L。絮凝剂粗品呈白色粉末状，具有多糖和蛋白质性质。

取絮凝剂粗品1 g，溶解于100 mL水，取2 mL测絮凝活性。静置15 min后，对照一直比较浑浊，有明显的悬浮颗粒，无明显的絮凝沉淀现象；处理管从加入絮凝剂后就开始絮凝，不断的有白色的絮凝物质从管中向底部沉淀。15 min后管中溶液透明清澈，悬浮颗粒很少，絮凝率超过95%。说明絮凝剂的絮凝效果比较理想（图3）。

图3 絮凝剂粗品的絮凝效果

3 讨论

酱油酿造生产过程中会产生大量的有机废水，随着人们对环境保护的重视，酱油生产的废水直接排放会对周围生态环境造成恶劣的影响。利用含高浓度有机物的酱油酿造废水作为廉价培养基，既可以充分利用废水中丰富的营养物作为产生生物絮凝剂的碳源和氮源，又可以降低水中的污染物，达到双重功效[13]。酱油废水中的粮食残留物等可以作为微生物生长和发酵的碳源，但试验表明酱油废水还需外加少量的糖作为微生物生长的碳源。而前期的研究表明，酱油废水中N的含量可达到1.5 g/L，酱油废水中富含的蛋白质、氨基酸等作为氮源能满足微生物生长和发酵的需求。研究同时表明，红平红球菌发酵过程能有效降低酱油废水BOD、SS等指标，起到处理污水的作用，但对于酱油废水的色度改变很小。

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