高产β-葡聚糖酶菌株初步筛选与鉴定

邵金华，朱智勇，刘 欢，邓 佳，欧阳青，李军艳

（湖南科技学院，湖南 永州 425100）

β-葡聚糖酶是一类能降解谷物中β-葡聚糖的水解酶类的总称，包括1，3-1，4-β-葡聚糖酶、1，3-β-葡聚糖酶、1，2-1，4-β-葡聚糖酶、1，4-β-葡聚糖酶和1，3-1，6-β-葡聚糖酶，均属于半纤维素酶类[1]。β-葡聚糖酶能降解β-葡聚糖分子中的β-1，3和β-1，4糖苷链，使之降解为小分子的还原糖和寡糖，失去亲水性和粘性。随着人们对β-葡聚糖酶的深入研究，β-葡聚糖酶在食品、酿造、饲料和日化等工业方面应用价值正逐渐地显现出来[2]。β-葡聚糖酶作为一种新型添加剂，具有广泛而显著的经济效益和社会效益，开发前景十分广阔[3]。笔者对β-葡聚糖酶进行了深入的生物学研究，旨在筛选出能产生适应不同应用目标的β-葡聚糖酶的野生菌株，为今后生产出活力高、稳定性好的β-葡聚糖酶提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试土样 采自湖南省永州市阳明山、菜地、路边、西山等地，取其3～10 cm深层土壤。

1.1.2 试 剂 标准大麦β-葡聚糖购自Sigma公司；β-葡聚糖，天津市光复精细化工研究所，纯度99.9%；其他试剂均为AR级或BR级商品试剂。

1.1.3 培养基 （1）基本培养基（g/l00 mL）：蛋白胨 1.0，牛肉膏0.4，琼脂 1.8，NaCl 0.4，pH值7.2,121℃灭菌25 min。（2）分离培养基（g/l00 mL）：大麦β-葡聚糖 0.2，刚果红 0.004，琼脂 1.8，KNO30.1，NaH2PO40.12，MgSO40.03，CaCO30.01，pH 值 7.2，121℃灭菌25 min。（3）发酵培养基（g/l00 mL）：大麦粉 4.0，玉米粉 3.0，豆饼粉 3.0，KH2PO40.002，Mg－SO40.02，CaCO30.05，pH 值 7.1，121℃灭菌 25 min。（4）PDA 培养基（g/l00 mL）：马铃薯（去皮）20.0，蔗糖（或葡萄糖）2.0，琼脂2，水100 mL，pH值自然，121℃灭菌 25 min。

1.2 方法

1.2.1 菌种初步筛选 （1）样品的采集与处理：在永州市阳明山、菜地、路边、西山等不同地点共采集了46个土样，经去杂、风干装入已灭菌的牛皮纸袋内，封好袋口，备用。（2）富集培养：称取处理过的土样l g，加入装有50 mL已灭菌的富集培养基中的三角瓶中，30℃恒温培养48 h，每4 h摇匀1次，每个土样做3个平行。富集培养48 h后进行平板分离。（3）菌种分离：将富集培养物用无菌生理盐水稀释成 10-2～10-7六个梯度，选择 10-4，10-5，10-6三个梯度试管菌种，用灭菌的移液管取0.5 mL，涂布接种到以β-葡聚糖为唯一碳源的分离培养基平板上，30℃培养2～3 d，每个梯度重复3次。从中挑取生长良好的菌落接种于斜面培养基保存。（4）菌种初筛：将分离出的菌种点接在初筛培养基平板上，置于30℃培养2～3 d，凡在菌落周围能使刚果红褪色形成透明圈的菌株，即为产酶菌株。将筛选出的菌株连续重复3次点接在初筛培养基上，挑选透明圈与菌落直径之比大的菌株，接种斜面保存并编号。（5）菌种纯化：将初筛出来的菌种点接在PDA培养上，连续培养5代，至每个菌种的每个菌株的菌落形态、颜色等相同，并在显微镜下观察菌丝体、孢子的形态，直至纯化为止。（6）菌种复筛：取斜面保藏的菌种，接种于新鲜的斜面培养基上进行活化，接种到液体产酶培养基中（250 mL三角瓶，内装50 mL已灭菌的液体产酶培养基），于30℃，150 r/min摇床恒温培养3 d。培养过程结束后，取发酵液进行β-葡聚糖酶活力的测定。（7）酶活力的测定：采用DNS比色法[4-5]。取4 mL摇瓶发酵液经8 000 r/min离心10 min。取上清液用0.2 mol/L、pH值5.0的乙酸缓冲液稀释适当倍数，取经40℃预热的此稀释液1.0 mL，加入经40℃预热的1.0% β-葡聚糖溶液1.0 mL，混匀，加入蒸馏水混匀，40℃下恒温反应10 min，然后加入2.0 mL DNS停止反应，摇匀，100℃水浴5 min，冷却至室温后用去离子水定容至5.0 mL，测定OD520值。取稀释酶液1.0 mL，先加入2.0 mLDNS，再加入1.0%β-葡聚糖溶液1.0 mL为空白溶液。酶活定义：在本试验条件下，每分钟分解β-葡聚糖产生相当于l μmol葡萄糖所需的酶蛋白的量定义为一个酶活单位。

1.2.2 菌种初步鉴定[6-7]（1）菌落形态特征观察：将保藏的菌种接种于新鲜的斜面培养基上，进行菌种活化，活化后轻轻点接于PDA平板中央，30℃下恒温培养2～3 d，3次重复，培养期间观察菌落形态特征，并进行记录、拍照。（2）显微镜下观察（插片法）：取融化并冷却至大约50℃的PDA培养基约20 mL倒平板，待培养基凝固后，将菌种划线在培养基上，以无菌操作用镊子将无菌的盖玻片以大约45°角插入培养基内，其中盖玻片与插入的面与划的线平行，每个平板插3个，将平板倒置，30℃下恒温培养，3次重复。待菌丝在盖玻片上的长度大约0.5 cm后，用镊子小心拔出盖玻片，擦去背面培养物，然后将有菌的一面朝上放在载玻片上，在显微镜下镜检。

2 结果与分析

2.1 菌种初筛结果

将分离后的菌株接种于初筛培养基平板上，30℃恒温培养，能够产生透明圈的菌株共有48株，如表1所示，透明圈直径与菌落直径之比>1.4的菌株有9株。

表1 平板初筛结果

2.2 菌种复筛结果

将初筛得到的9株菌株进行纯化，纯化后的菌株接种于产酶培养基中进行摇瓶培养，分析各菌株的产酶活力情况，结果如图1所示，透明圈直径与菌落直径之比最大以及酶活最高的菌株为ZJ2132，因此，确定该菌株为后续研究的出发菌株。图2为ZJ2132纯化后30℃培养48 h后产生的形态。

图1 初筛菌株产β-葡聚糖酶活力比较

图2 ZJ2132在初筛培养基上的菌落形态

2.3 菌种鉴定

2.3.1 菌落形态特征 将活化后的ZJ2132菌种划线接种于PDA培养基上，30℃恒温培养3 d后，菌落平板如图3所示：培养1 d时，菌落呈圆形、白色、致密，菌落直径1 cm，菌丝呈白色，纤细；培养2 d时，菌落棉絮状，产孢从束区排列成同心圆轮纹，中央产生绿色孢子，中央变成绿色，大部分菌丝为基内菌丝，匍匐生长，气生菌丝较少，四周新生的菌丝为白色，菌落直径达3.0 cm，中央出现隆起；培养3 d时，菌落圆形、致密，呈同心圆环状向四周拓展，直径达5.5 cm，绿色孢子布满菌落，呈蓝绿色，白色菌丝被覆盖，培养基颜色无明显变化，没有明显的渗出物，无明显气味。

图3 ZJ2132菌种划线接种形态

2.3.2 显微镜下的观察（插片法） 菌种采用插片法进行制片，然后在显微镜下观察，结果如图4所示：菌种ZJ2132的菌丝为树枝状，非轮枝状，有隔；分生孢子梗光滑、较粗，淡褐色；顶囊呈球形，淡绿色；小梗双层、无色，分生孢子呈卵圆形。

图4 ZJ2132镜检图（油镜100倍）

根据《真菌鉴定手册》和《常见与常用真菌》中关于木霉属的描述，实验中菌落、菌丝及孢子等表现出的形态特征，将ZJ 2132菌株初步鉴定为木霉属中的Trichoderma sp.。

3 结论

从土壤中采用刚果红葡聚糖培养基对产生菌进行筛选，分离出9株透明圈直径与菌落直径之比>1.4的菌株；通过摇瓶复筛，确定了一株产β-葡聚糖酶酶活相对较高的菌株，命名为ZJ2132，其产酶活性为142.36 U/mL；通过对菌株ZJ2132的菌落和个体形态特征的观察，初步确定该菌株ZJ2132为木霉属中的Trichoderma sp.。该菌株酶活高于大多文献报道的产β-葡聚糖酶酶活，因此极具应用开发价值。

[1]郭小权，胡国良，刘 妹.β-葡聚糖的抗营养作用及β-葡聚糖酶在饲料中的应用[J].江西饲料，2001（2）：11-13.

[2]张 洁、蔡敬民，吴 克，等.β-葡聚糖酶的研究与应用前景[J].安徽农业科学，2003，31（5）：893-896.

[3]李孝辉、钱玉英.大麦饲料的开发及β-葡聚糖酶的应用[J].粮食与饲料工业，1997，（8）：19-20.

[4]张龙翔，张庭芳，李令媛.生化实验方法和技术[M].北京：高等教育出版社，1997.

[5]刘永举，王清吉，王江青，等.DNS法测定饲用β-葡聚糖酶活力[J].中国饲料，1999，（18）：26-27.

[6]魏景超.真菌鉴定手册[M].上海：上海科学技术出版社，1979.

[7]中国科学院微生物研究所《常见与常用真菌》编写组.常见与常用真菌[M].北京：科学出版社，1973.