RNA干扰载体构建方法的研究进展

粟 挺 ，刘爱玲 ，陈信波

（1.湖南农业大学生物科学技术学院，湖南 长沙 210128；2.湖南农业大学作物基因工程重点实验室，湖南 长沙 410128）

随着模式植物拟南芥和水稻全基因组测序工作的完成，植物基因组学的工作重心已由结构基因组学转向功能基因组学，因此迫切需要一种高效、高通量分析方法从生物个体的整体水平阐明基因功能。RNA干扰是通过外源或内源性的双链RNA在细胞内诱导同源序列的基因表达沉默的现象，其表现的性状类似于基因功能缺失产生的表型[1-2]。RNA干扰现象自20世纪90年代中期被发现以来，就被广泛应用于基因功能的分析验证，成为后功能基因组学研究的热点；在农作物选育方面也被广泛应用于农作物的品种改良和农作物的抗病毒[3]研究。进行RNA干扰研究需构建可转录为双链RNA的表达载体，然后获得基因沉默的转基因植株，进而分析目的基因的功能，这种方法的优点是可以获得遗传上稳定的突变体。强启动子下游插入反向重复片段的表达载体是诱导RNA干扰的最基本结构，最有效的双链RNA构件是能转录的发夹RNA（hairpin RNA,hpRNA）[4]。研究者一般从方法是否简便、快捷、成功率高来评价植物RNA干扰载体构建方法的优劣。笔者对目前广泛使用的构建RNA干扰表达载体的4种方法进行了归纳和总结。

1 传统的“酶切—连接”方法构建RNA干扰表达载体

“酶切—连接”方法是构建RNA干扰载体最常用的方法，被广泛应用于各种生物之中[5-8]。其构建过程是：通过PCR方法得到目的基因的片段（添加了合适的酶切位点），使之正反相连形成顺式片段和反式片段，然后在顺反式片段之间插入一段中间间隔序列以增强基因沉默效果[9-10]，最后将表达载体和RNA干扰片段相连接，形成可用于遗传转化的RNA干扰表达载体。

传统的“酶切—连接”方法对于在载体上添加1到2个基因比较容易，对于需添加多个基因的表达载体是比较困难的。除此之外，这种方法的试验周期比较长，至少需要3个“酶切—连接”的循环才能完成载体构建，耗时耗力；构建成功率不太高，在添加最后一个基因片段时，无论是顺式片段还是反式片段连接到表达载体上都比较困难；对原始载体和目的片段的限制条件比较多，原始载体至少有4个可用酶切位点，这就增加了原始载体选择的难度。传统的“酶切—连接”方法构建RNA干扰载体是最原始的构建方法，虽然成功地构建了多个植物RNA干扰表达载体，但其过程相对比较繁琐，受到限制因素也比较多，不适合做高通量的研究。

2 “零背景筛选”技术构建RNA干扰表达载体

“零背景筛选”技术是Chen等[11]开发出来的一种高通量和高效率的构建RNA干扰表达载体的方法。该方法只需简单的两步PCR反应（图1）就能形成干扰载体所需的“发夹”结构，免去了传统方法中一系列的“酶切—连接”过程；并且此方法筛选阳性克隆的方法简单，且出现“假阳性”的概率非常小，几乎为零，所以叫做“零背景筛选”。通过中间载体中的致死基因ccdB来筛选阳性克隆，与目的基因连接成功的载体能存活，反之不能存活。此方法只需两步简单的PCR反应和一次“酶切—连接”过程就能完成RNA干扰表达载体的构建。其具体步骤如下。

2.1 两步PCR反应

第一步，PCR过程中使用的引物P2和P4是在正常引物前加上一个含有特殊序列的接头，而引物P2前面的接头和P4前面接头的序列是反向互补的。第二步，PCR过程所用的DNA聚合酶是一种特殊的酶，它可以在PCR产物后面加上A尾巴，如图1。

图1 两步PCR反应

2.2 一次“酶切—连接”过程

表达载体PCXUN和PCR产物的“酶切—连接”（图2）。表达载体PCXUN经过XcmI限制性内切酶酶切后，会形成一个T尾巴，正好与PCR产物的A尾巴形成TA克隆。由于原始表达载体PCXUN中的致死基因ccdB被酶切掉，重组干扰载体不含致死基因ccdB，因此阳性克隆能存活。

图2 “酶切-连接”过程

“零背景筛选”技术通过经典的重组PCR方法[12]将两个或多个基因片段通过一个基因片段的3′端与另一个基因片段的5′端的互补，利用重叠延伸的方法进行高效和快速的体外基因片段拼接。应用此方法构建目的基因的RNA干扰构件的关键是引物设计，在两条引物前需分别加上一对序列反向互补的接头，此外这个方法需要进行两轮PCR反应，应使用保真性高的DNA聚合酶以保证扩增的真实性。在阳性重组子的筛选过程中由于原始载体致死基因ccdB的存在，导致阳性重组子的筛选效率极高。此方法只需两步PCR反应就能得到RNA干扰构件[13]，只需一步酶切—连接过程即可以将干扰构件连接于载体上，构建成RNA干扰表达载体，所以大大降低了对原载体上可用酶切位点的要求。使用这种技术，Chen等构建了一套由12个临时载体和12个稳定载体组成的遗传转化载体用来研究植物的基因表达，并在水稻和拟南芥中验证了这些载体的表达。这种方法较传统构建方法更简便、适用性更广泛。

3 Gateway技术构建RNA干扰表达载体

Gateway技术是Invitrogen公司开发的一项基因克隆和表达的新技术，只需BP和LR两个反应就可以完成RNA干扰表达载体的构建，不需要使用限制性内切酶和连接酶。

Gateway技术过程：BP反应（图3）主要是将目的基因或PCR产物重组入供体载体(donor vector)。在获得目的基因PCR片段时，需在PCR产物的5′端加入attB1位点，3′端加入attB2位点，供体载体两端具有attP1和attP2位点，PCR产物和供体载体在BP反应酶催化下，通过同源重组形成新的位点attL1和attL2，生成带有目的基因的入门载体。LR反应（图4）主要是将目的基因从入门载体重组入目的载体，反应由LR反应酶混合物催化。入门载体基因两端具有attL1和attL2位点，目的载体上含有attR1和attR2位点，在LR反应酶作用下发生定向重组，形成新的位点attB1和attB2，从而将目的基因转移到目的表达载体中。筛选阳性克隆的机制是：入门载体质粒上带有卡那霉素抗性基因，而目的载体质粒上带有壮观霉素抗性基因，重组目的载体质粒的选择标记为壮观霉素[14]。具体工作原理见图4。

图3 BP反应

图4 LR反应

Gateway技术是一项基因克隆和表达的新技术，与传统的“酶切—连接”方法构建表达载体比较，该技术具有耗时短、操作简单等特点，即只需通过高效的BP和LR反应就可实现把目的基因定向转入表达载体中，克隆效率可达到95%[15]。Gateway技术应用于构建RNA干扰表达载体具有简便、快捷、成功率高、对原始载体和目的片段的限制少等优势，可避免构建RNA干扰载体时存在的困难和繁琐的“酶切—连接”步骤。很多科研工作者已利用Gateway技术成功地构建了多种RNA干扰表达载体用于研究基因的功能，姜玲等[16]成功构建了番木瓜环斑病毒CP基因的RNA干扰表达载体；徐化学等[17]利用Gateway技术快速成功地构建了水稻OsDAD1基因的RNA干扰表达载体并用以研究基因的功能；晏立英等[18]构建了花生条纹病毒基因的RNA干扰表达载体。

4 以人工miRNA为基础的方法构建RNA干扰表达载体

miRNA是一类内源单链非编码小分子RNA，约为22 nt[19-20]，广泛存在真核生物中。其小分子RNA和靶mRNA通过特异的碱基配对结合，形成RISC沉默复合体，阻碍基因的正常表达。人工miRNA[21-22]技术指利用miRNA的表达特性，使用生物体内源的miRNA前体[23-24]作为人工miRNA的表达框架，产生出小分子RNA介导的靶基因沉默。因此，在二级结构不变的前提下，可以通过改变生物体内源miRNA前体的一些核苷酸，生成针对特异目的基因沉默的人工miRNA，目前被广泛使用的miRNA前体骨架有 ath-miR159a，ath-miR164b，ath-miR169d，ath-miR172a，ath-miR319a和 osa-miR528。

Weigel等[25]建立了一个人工miRNA设计平台，在 WMD3（Web MicroRNA Designer,http://wmd3.weigelworld.org/cgi-bin/webapp.cgi）系统中，可以对100多种植物设计人工miRNA。使用WMD3的“Designer”工具，选择所要干涉的植物的基因组数据库，输入目的基因序列，在线提交，该系统通过和植物基因组数据库比对，防止“脱靶”，并根据人工miRNA的相关参数（如Tm值等）列出候选的人工miRNA。Weigel等提供了基于拟南芥miR319a、水稻miR528、莱氏衣藻的pChlamiRNA2/3载体作为构建人工miRNA的模板，用PCR方法替换载体上miRNA片段，构建成人工miRNA表达载体。

人工miRNA技术是一项新兴的生物技术，具有高效、精确、可控等优点，是替代RNA干扰的有效工具。几乎所有可以利用RNA干扰的地方都可以用人工miRNA替代。与RNA干扰技术相比，人工miRNA具有独特的优势。人工miRNA可以同时干涉多个序列具有同源性的基因，因此可以用来研究多拷贝的基因或功能存在互补效应的基因；利用人工miRNA可以建立基因沉默的突变体库，进行基因组功能研究。

5 结语

RNA干扰技术作为一种基因工程策略，被广泛应用于农作物的遗传改良、抗病毒和抗寄生线虫[26]等方面的研究。构建RNA干扰表达载体是最常用和最基本的试验步骤。随着分子生物学技术的不断发展，植物RNA干扰表达载体的构建方法也会不断推陈出新，变得越来越简便、有效。“零背景筛选”技术突破了传统的限制性酶切法进行基因连接的概念，将重组PCR技术应用于植物RNA干扰表达载体的构建，是近两年发展起来的一项新技术，被证明是可行的；Gateway技术利用同源重组的原理来构建RNA干扰表达载体，也是一种简便、快捷的方法，适合高通量的研究；人工miRNA的方法具有干扰成功率高、并且允许碱基错配、允许同时表达几个人工miRNA分子，组织特异性的调节表达等优点[27]，在植物发育调控、逆境应答及激素调节等方面应用价值更高[28]。随着基因工程技术的发展，富有创新性的RNA干扰表达载体的构建方法必将为植物基因功能研究提供更有力的技术支撑。

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