Toll样受体4致乙型肝炎病毒免疫损伤的研究进展

朱 楠 综述 袁伟杰 审校

乙型肝炎病毒(HBV)并非严格嗜肝性病毒，因此不但可致肝脏病变，还可引起其他组织损害。随着分子生物学技术发展，现已证实，外周血单个核细胞、胰、脾、皮肤、肾等组织和细胞中均存在HBV[1]。然而，HBV诱导组织细胞损伤的具体机制尚不明确，可能与以下因素有关：(1)病毒因素，如病毒基因型变异、病毒蛋白过度表达及乙肝病毒X抗原(HBxAg)、HBV剪接蛋白(HBV spliced protein,HBSP)等的作用；(2)宿主抗HBV免疫反应；(3)肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TNF-related apoptosis-inducing ligand，TRAIL)介导的肝细胞凋亡；(4)抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(antibody dependent cell mediated cytotoxicity，ADCC)等。宿主抗HBV的免疫反应及其随后诱发的非抗原特异性炎性反应是目前较为认同的损伤机制[3]。

病毒能否在细胞内生存和复制取决于宿主的抗病毒机制。天然免疫系统的细胞可表达模式识别受体(pattern recognition receptors，PRR)，以识别病原体的结构成分，其中Toll样受体(Toll-1ike receptors，TLR)是病原识别受体中最重要的家族，已发现人类TLR家族成员有11种，Toll样受体4(TLR4)是最早发现能够直接介导机体与病原体反应的受体，主要表达于单核巨噬细胞、中性粒细胞、树突状细胞等组织细胞表面[4，5]，其信号分子是连接先天和后天免疫的重要桥梁。既往研究大多集中于其在细菌感染中的作用，近年来，TLR4在抗病毒免疫中的作用也日益受到关注。TLR4能识别多种病毒，如呼吸道融合病毒(RSV)、HBV、丙型肝炎病毒(HCV)、汉坦病毒等，启动细胞内信号转导通路，诱导特异性免疫反应，分泌细胞因子/趋化因子，发挥抗病毒作用[6]。

TLR4对HBV的识别

TLR4属于I型跨膜蛋白，可分为胞外区、胞质区和跨膜区三部分，其胞外区由富含亮氨酸的重复序列(LRRs)组成，可促进蛋白质之间的黏附，并识别病原体或其产物。胞内区与白细胞介素1受体(interleukin 1 receptor type I，IL-1R)的胞内区有高度同源性，又被称为Toll/IL-1受体(Toll/IL-1 receptor，TIR)同源区，是TLR4和IL-1R下游信号传导的核心元件，参与信号活化传导。HBV包膜糖蛋白可被TLR4识别，在感染初始阶段，只要有包膜蛋白与细胞表面结合，病毒就会被识别，此过程早于HBV基因表达或复制，因此，引发机体对HBV的固有免疫应答反应也更早[7]。

TLR4的信号转导及其抑制HBV的相关通路

TLR4激活的信号通路TLR受体激活的信号传导通路包括髓样分化因子88(myeloid differentiation factor 88，MyD88)依赖型和MyD88非依赖Toll样受体相关的干扰活化子(TRIF)依赖型[8]。脂多糖(LPS)是TLR4的特异配体，可促进细胞内TLR4表达上调。TLR4有两条信号通路：一条与核因子κB(NF-κB)激活有关，另一条有cjun氨基末端激酶/应激活化蛋白激酶(JNK/SAPK)的参与。MyD88是这两条途径的接头蛋白，从MyD88处开始分别激活下游信号分子。有关TLR信号传导通路的研究还有待进一步深入，其中研究较为清楚的是NF-κB激活过程[9]：LPS的脂质A首先在胞外与LPS结合蛋白(LBP)形成LPS-LBP复合物，再由LBP将LPS转移到细胞膜表面的CD14上，在分泌蛋白MD-2的作用下与TLR4结合，TLR4聚合使得信号传导到胞内，由于TLR4的胞内区与IL-1R的胞内区有高度同源性，都有TIR区，因此TLR的胞内信号传导过程与IL-1非常相似。活化TLR4的胞内TIR样区与接头蛋白MyD88羧基端的TLR受体域结合，而MyD88通过氨基端与IL-1受体相关激酶的氨基端死域(death domain)结合，导致白细胞介素-1受体相关激酶(IRAK)自身的磷酸化而激活，获得游离IRAK、IRAK2以及IRAK4，继而激活肿瘤坏死因子受体相关因子6(TRAF-6)，TRAF-6使IRAK和IRAK2连接于有丝分裂原结合蛋白激酶(MAPK)家族其中的NF-κB诱导激酶(NIK)，进一步活化I-κB家族α、β激酶，导致I-κB两个丝氨酸位点磷酸化，最终导致I-κB泛素化而降解，使NF-κB从静息状态下与I-κB结合的抑制状态得以解除，游离的NF-κB转位到胞核，其活性二聚体可启动细胞因子如IL-1、1L-6、IL-8、IL-12等，辅助黏附分子CD80和CD86基因也得以转录(图1)。

图1 TLR4激活的信号通路

TLR4抑制HBV的通路在感染HBV的肝细胞表面，TLR4通过非MyD88途径激活，以I型干扰素依赖方式抑制HBV复制[10]，即TLR4通过TRAM(TRIF-related adaptor molecule)与具TIR结构域的调节分子TRIF(Toll/interleukin-1 receptor domain containing adaptor)进行非MyD88依赖性途径的信号转导，促进β干扰素(IFN-β)和IFN诱导基因的表达，其主要生理学活性有赖转录因子IRF-3(interferon regulatory factor 3)。TRIF作用于IRF-3，后者活化形成同源二聚体转位入核，诱导IFN-β基因表达。TRIF途径除了增强促炎症细胞因子分泌，还介导IFN-α/β分泌、共刺激分子表达以及树突状细胞成熟。

TLR4抑制HBV复制的特异性免疫反应

TLR4相关通路可促进IFN、白细胞介素(IL)等细胞因子分泌，使免疫细胞成熟并杀伤病原体[11]。

诱导CD4+T细胞，调节Th1和Th2平衡TLR4可促进T细胞活化和成熟[12]。Funderburg等[13]发现，感染HIV患者体内的TLR4可以诱导CD4+和CD8+T淋巴细胞激活，使CD4+T细胞不成比例凋亡，而CD8+T细胞仍贮留在淋巴组织，导致免疫缺陷。Zhang 等[14]发现，HBV感染肝细胞过程中，CD4+Th细胞与肝细胞损伤的免疫调节密切相关。CD4+Th细胞能够识别巨噬细胞和B细胞上与主要组织相容性复合体(MHC) II类分子结合的肽，T细胞受体对MHC II-肽复合物的识别导致T细胞激活。根据产生细胞因子的不同，CD4+Th细胞又可分为Th1和Th2细胞。Th1细胞产生的IFNγ和IL-2主要在细胞免疫中起重要作用。Th2细胞产生的IL-4、IL-5、IL-10、IL-13起调节体液免疫的作用。Th1和Th2之间的平衡(Th1/Th2)影响着各种免疫疾病的结局。近年研究证实，TLR4通过诱导IFN和TNF等细胞因子合成，调节Th1和Th2的平衡，并与调节性T细胞(Treg)的免疫抑制有关，进而发挥抗病毒作用[15，16]。抗原特异性Th1细胞进入肝脏，可识别由肝非实质细胞加工呈递的抗原，Th1细胞或通过释放Th1型细胞因子促进巨噬细胞释放炎症因子，通过Fas/FasL非依赖的方式诱导肝损伤，细胞因子成为扩大肝损伤的重要因素。

TLR4介导自然杀伤(NK)细胞、树突状细胞(DC)及细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的激活TLR4信号还能募集活化NK细胞和DC，促进DC向T细胞提呈抗原，启动T细胞应答。成熟的DC表面高表达人类白细胞抗原DR(HLA-DR)、CD86、CD80等共刺激分子，可高效激活未致敏T淋巴细胞，产生特异性细胞免疫。NK细胞释放IFN-γ，诱导T细胞介导的免疫反应，导致感染细胞凋亡；细胞毒性T淋巴细胞激活Kupffer细胞，产生TNF-α，从而诱导肝细胞凋亡[17]。CTL通过与靶细胞接触，诱导感染细胞凋亡，但是感染病毒的肝细胞数量远远超过CTL和CD4+Th细胞，并且肝脏的组织体系限制了CTL的自由进入[18]。T细胞活化产生的细胞因子又进一步激活单核巨噬细胞，借助TLR4的桥梁作用，将固有免疫(innate immunity)和获得性免疫(adaptive immunity)紧密联系起来。

另外，TLR4通过诱导一氧化氮合成酶(iNOS)表达和激发HBV特异性免疫参与体内抗HBV过程[19]。Kanzler等[20]研究证实，活化TLRs可提供治疗HBV和HCV感染的新策略，靶向TLRs的信号途径可能是治疗肝炎病毒感染的新选择，并为研制新型抗HBV药物提供理论基础。但刘华等[21]研究发现，大剂量HBsAg可干扰TLR信号活化，影响抗原呈递细胞功能，帮助病毒逃逸机体的免疫监视，加重HBV感染。近年来，Wei等[22]认为线粒体抗病毒信号(mitochondrial antiviral signaling，MAVS)和乙肝病毒X蛋白(HBX)之间存在一定的关系，并发现HBV可通过HBX下调MAVS，靶向调节维甲酸诱导基因1(retinoic acid-inducible gene-1，RIG-1)信号通路，从而削弱固有免疫的抗病毒反应。随着研究不断深入，相信会有更多的新发现。

TLR4激活非特异性炎症反应抑制HBV复制

促进细胞因子合成与释放，引发炎症反应是TLR4最突出的生物学功能[23]。单核巨噬细胞、DC等通过膜表面的TLR4感知入侵病原体的病原相关分子模式(PAMP)刺激后，经由胞内信号传导通路，最终进入胞核内活化NF-κB启动核内相关基因，转导出相应的mRNA，从而合成IL-1、IL-6、IL-8、IL-12、TNF-α及IFN-γ等细胞因子并释放到细胞外，引起粒细胞、巨噬细胞趋化聚集，毛细血管通透性增高，淋巴细胞浸润等炎症反应，发挥早期免疫应答效应。Isogawa等[24]给转基因小鼠静脉单独注射TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR7、TLR9的特殊配体，观察其对体内病毒复制的影响，发现TLR4的配体LPS可以在24h内通过IFN-α/β依赖途径在肝单核细胞抑制对HBV复制，并诱导产生抗病毒细胞因子。TLR4突变小鼠注射pHBV3.6后，与非突变小鼠比较，肝细胞HBsAg表达及TLR4+浸润白细胞明显增多；肝内淋巴细胞表达IFN-γ、TNF-α、IL-12的能力显著降低[19,25]；为避免机体免疫反应对研究过程的干扰，我们应用LPS体外刺激HBV感染的近端肾小管上皮细胞中TLR4表达，发现细胞培养上清中HBV-DNA及HBV抗原表达水平下降，同时细胞的增生也出现了抑制，推测活化的TLR4可通过下游信号通路激活各种炎症因子的表达，而这些炎症因子诱发细胞内的炎症反应，并导致细胞损伤或细胞凋亡，进而使HBV的复制得到抑制。有学者在动物模型中也发现激活TLR4可明显诱导IFN-α/γ抗病毒细胞因子的产生，并抑制HBV复制，使诱导型iNOS表达减少[26]。因此，TLR4在肝细胞中的表达可能与肝脏组织的局部免疫状态有关，激活TLR4可能对控制慢性HBV感染有益。

综上所述，TLR4与HBV包膜蛋白结合后，通过多种信号途径促进免疫细胞膜表面表达相关免疫分子，促进免疫细胞成熟和分化。并随着免疫反应激活进一步诱导产生非特异性炎症，加剧肝细胞及肝组织破坏。因此，TLR4及其信号转导在HBV感染导致肝细胞损伤中起重要作用。由于HBV感染肾脏的方式及免疫特性的复杂性，迄今为止HBV损伤肾组织的机制尚不完全清楚。我们通过免疫组化法已经在HBV相关肾炎患者肾组织中发现TLR4定位在肾小管及肾间质。随着针对TLR4研究的不断深入，机体感染HBV后TLR4信号转导途径在肾脏等器官、组织、细胞免疫损伤中发挥的作用将得到进一步阐明。

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