脑出血小鼠行为学改变和低氧诱导因子-1 α的表达△

西安市中心医院 (西安 710004)张 琳 徐 曦 谭 敬 肖新莉 马 勇

低氧诱导因子 -1 α(Hypoxia inducible factor-lα,HIF- lα)是低氧应答过程中起重要作用的转录因子,具有促进无氧代谢,血管形成,血管扩张及红细胞携氧的作用。 HIF- lα对脑缺血缺氧损伤具有保护作用,其作用机制为改善脑缺血后的能量代谢障碍,促进血液动力学恢复,抑制兴奋性氨基酸的神经毒性,减少细胞凋亡等[1,2]。但是一些研究也发现,HIF-lα过度表达使细胞内 P53水平增加,促进 Caspases 3的激活表达,导致神经毒性从而促进细胞凋亡[3]。本研究旨在观察脑出血(Intracerebral hemorrhage,ICH)期间脑组织中HIF-1 α表达的时程和分布特征,以探讨脑出血后HIF-1 α表达的意义,为缺血性脑血管病的治疗提供新的途径。

材料与方法

1 材 料

1.1 动物与分组:选用西安交通大学医学院动物实验中心提供的健康成年雄性昆明小鼠 40只,体重在25～ 30g,由动物中心配制的普通小鼠饲料喂养,饮用自来水,分成假手术组组和脑出血组。脑出血组于术后7d、14d处死,冰冻切片,用于低氧诱导因子表达免疫组化测定,各组 5只。

1.2 药物与试剂:兔抗小鼠 HIF-1 α抗体(美国Bioworld,Millipore公司提供),ABC试剂盒(美国Vector公司提供),羊抗兔抗体、DAB显色试剂盒(由北京中山公司提供),Ⅳ型胶原酶(美国 Sigma公司提供)。

1.3 仪器:脑立体定位仪为美国 Stoelting公司生产,低温恒冷冰冻切片机(HM 505E Leica)系德国莱卡公司生产,荧光显微镜(Nikon E800)为日本尼康公司生产,微量进样器为上海玻璃仪器厂生产。

2 方 法

2.1 实验性脑出血模型的制作及处理:动物经10% 水合氯醛(300 mg/kg)腹腔注射麻醉后,俯卧位固定于脑立体定位仪上,前、后囟在同一水平面。在两耳和两眼之间皮肤正中线上纵形切开,暴露前囟。在前囟前 0.5mm,旁开 2.5mm处用牙科钻垂直钻透颅骨,5 μL微量进样器固定于立体定位仪上,由骨孔缓慢进入纹状体,进针深度距颅骨表面 6mm。将Ⅳ型胶原酶 0.075U注入,注射时间 10min,留针 10min,缓慢退出注射器,骨蜡封闭骨孔,缝合头皮。术后观察动物至清醒后,归笼饲养。假手术组动物在同位置注入等量生理盐水。

2.2 行为学观察:采用 Berderson评分法[4]。轻抓尾巴,提起大鼠高于桌面 10 cm,正常大鼠前爪伸直。0分:没有神经功能缺损;1分:左侧腕关节、肘关节屈曲,肩内收屈曲;2分:上述体征+向左侧阻力下降;3分:活动时向左侧转圈(追尾)。

2.3 组织切片制备和组织学观察:所有小鼠麻醉后经左心室灌注冰肝素生理盐水 200 ml和 4%多聚甲醛 400 ml(0.1 M PB,pH 7.4),断头取脑,组织块后固定于 4%多聚甲醛 4℃过夜,入 30%蔗糖(0.1 M PB,pH 7.4)2～3d至组织块沉底,液氮骤冷,组织保存于-80℃。切片时在前囟前 0.4 mm至前囟后1.4 mm范围,用冰冻切片机行冠状切片,片厚40 μ m,切片裱于 APES处理的载玻片上,-30℃保存待用。 HE染色用于组织学观察。

2.4 HIF-1 α免疫组织化学染色:冰冻切片 0.01 M PBS漂洗,滴加正常兔血清封闭非特异性抗原,室温湿盒孵育 1h,去除血清,滴加一抗,4℃湿盒过夜,0.01 M PBS漂洗,滴加生物素化二抗,湿盒室温孵育2h,0.01 M PBS漂洗,ABC室温孵育 1h,0.01 M PBS漂洗,DAB显色 5～10min,蒸馏水漂洗,梯度酒精脱水、二甲苯透明、中性树胶封片、观察。

2.5 细胞计数:细胞计数在 Nikon 800显微镜高倍视野 400倍下进行,图像显示于计算机显示屏上。用 IPP(Image pro plus 6.0)医学图像分析软件计数每个视野的 HIF-1 α阳性细胞数,取均数为各时点HIF-1 α阳性细胞数。以细胞密度(阳性细胞数 /mm2)表示,5张切片的均值代表该小鼠的计数结果。

2.6 统计学处理:用 SPSS10.0软件包进行分析,计量资料以均数±标准差(±s)表示,采用方差分析(One-way ANOVA)。

结 果

1 ICH后组织学改变:胶原酶注射后 1d可形成稳定的血肿,血肿位于纹状体。在 HE染色切片上,ICH后第 7天,HE染色光镜下可见出血灶与正常脑组织间有一过度带即血肿周围区,血肿周围水肿,组织疏松,星形细胞肿胀,神经细胞变性、坏死,出血灶周边毛细血管增生伴炎细胞浸润,同侧侧脑室受压、变小(图 1A);第 14天时出血灶明显缩小,血肿周围大量炎性细胞 (图 1B)。

图1 脑出血组织的 HE染色 (A:ICH后 7d;B:ICH后14d。标尺在 B:长度=2mm)

2 ICH小鼠行为学改变:Berderson行为学评分显示 ICH后第 7天小鼠出现严重的神经功能障碍,神经功能评分显著低于正常对照组(P＜0.05),见表 1。

表1 小鼠 ICH后 Berderson行为学评分 (±s,分)

表1 小鼠 ICH后 Berderson行为学评分 (±s,分)

与假手术组比较,* P＜0.05

组 别 n 第 7天 第 14天假手术组 5 0.2±0.4472 0.3333±0.5164脑出血组 5 2.2± 0.8367* 1.8333±0.7528*

图2 大脑皮质 HIF-1α蛋白表达(A:假手术组 HIF-1α表达;B:ICH后 7d;C:ICH后 14d。 标尺在 C:长度=200 μm)

3 ICH小鼠大脑皮质 HIF-1 α蛋白表达动态变化:假手术组脑组织皮层有极少量表达 HIF-1 α的阳性细胞。 ICH组各时间点 HIF-1 α表达高于假手术组(图 2),差异具有统计学意义(P＜0.05)。

表1 小鼠 ICH后出血侧大脑皮质 HIF-1 α阳性细胞计数(个 /mm2)

4 ICH小鼠出血灶周围半暗带的 HIF-1 α蛋白表达动态变化:假手术组纹状体有极少量表达 HIF-1 α的阳性细胞。 ICH组各时间点 HIF-1 α表达高于假手术组(图 3),差异具有统计学意义(P＜0.05)。

图3 脑出血灶周围半暗带 (纹状体)的 HIF-lα蛋白表达

表3 小鼠 ICH后出血灶周半暗带 HIF-lα阳性细胞计数(个 /mm2)

讨 论

小鼠 ICH后存在严重的行为学障碍,这种障碍在ICH后第 2天最为明显,在 1～ 4周逐渐恢复。本实验结果显示 ICH后第 7天小鼠依然表现有严重的神经功能障碍。

HIF-1是一种缺氧诱导的主要转录因子,含一个α亚单位和一个β亚单位,其中 HIF-1 α是可调控的功能单位,受氧浓度变化的调节,缺氧后其转录活性增加。目前认为 HIF-1 α可以作为组织缺氧的标志[5]。既往研究发现 HIF-1 α上调后具有神经保护作用[6]。Yuan LB等研究发现 HIF-1 α在缺氧缺血性脑损伤的保护中起着重要作用[7,8]。无论是在全脑缺血、局灶性脑缺血时,脑组织中都发现有 HIF-1 α的激活。 Wu W等[9]将基因重组的腺病毒 HIF-1 α转染的神经干细胞移植到脑缺血 24h的大鼠侧脑室,腺病毒 HIF-1 α转染的神经干细胞移植组较其他组神经功能改善更加明显,并且发现改组的缺血损伤区域第Ⅷ因子阳性细胞数目增加,表明 HIF-1 α的表达可促进血管新生。因此,运用 HIF-1 α基因治疗是缺血性脑损伤治疗中的新的途径。本实验的结果表明在缺氧情况下,HIF-1 α在损伤缺氧区表达明显增加,用于对缺氧的应激,与以往的研究结果一致。

[1]Bernaudin M,Tang Y,Reilly M,et al.Brain genomic response following hypoxia and reoxygenation in the neonatal rat. Identification of genes that might contribute to hypoxia induced ischemic tolerance[J].J Biol Chem,2002,277(25):39728-39738.

[2]Harten SK, AshcroftM,MaxwellPH. Prolyl hydroxylase domain inhibitors:a route to HIF activation and neuroprotection[J].Antioxid Redox Signal,2010,12(4):459-80.

[3]Rohwer N,Dame C,Haugstetter A,et al.Hypoxiainducible factor 1alpha determines gastric cancer chemosensitivity via modulation of P53 and NF-kappaB[J].PLO S One,2010,5(8):e12038.

[4]Bederson JB,Pitts LH,Tsuji M,et al.Rat middle cerebral artery occlusion:evaluation of the model and development of a neurologic examination[J].Stroke,1986,17:472-476.

[5]胡 明,肖新莉,刘 勇.低氧诱导因子-1研究进展 [J].医学综述,2006,12(21):1283-1285.

[6]Du F,Wu XM,GongQ,etal.Hyperthermia conditioned astrocyte-cultured medium protects neurons from ischemic injury by the up-regulation of HIF-1alpha and the increased anti-apoptotic ability[J]. Eur J Pharmacol,2011,M 23.[Epub ahead of print]

[7]Yuan LB,Dong HL,Zhang HP,et al.Neuroprotective effect of orexin-A is mediated by an increase of hypoxiainducible factor-1 activity in rat[J].Anesthesiology,2011,114(2):340-54.

[8]Shi Q,Zhang P,Zhang J,et al.Adenovirus-mediated brain-derived neurotrophic factor expression regulated by hypoxia response element protects brain from injury of transient middle cerebral artery occlusion in mice[J].Neurosci Lett,2009,465(3):220-5.

[9]Wu W,Chen X,Hu C,et al.Transplantation of neural stem cells expressing hypoxia-inducible factor-1alpha(HIF-1alpha)improves behavioral recovery in a rat stroke model[J].J Clin Neurosci,2010,17(1):92-5.