LTS液基细胞学联合 HPV16/18检测筛查早期宫颈癌的价值

第四军医大学唐都医院病理科(西安 710038)

兰 淼 李艳红△ 朱少君 巩 丽 韩秀娟 任 拼 姚 丽 张 伟#

宫颈癌一直是影响妇女健康的主要疾病。近年来研究发现,大约有 90%的人类宫颈癌细胞中可检测到HPVDNA,由于宫颈癌存在着一个较长的、可逆转的癌前病变期,早期宫颈癌患者 5年治愈率高达 90%,所以早期发现一过性 HPV携带者对早期诊断、治疗尤为重要[1]。L TS技术对传统的巴式涂片进行了改良,制备的薄层涂片细胞信息量大,而且清晰便于阅读。本文对同一病人的标本采用 HPV16/18和 LTS联合检测,以探讨其在宫颈癌前病变中的诊断意义,现报道如下。

材料与方法

1 病例选择 选择 2010年 4月至 2011年 3月在我院妇科门诊及生殖中心就诊、自愿行 LTS检查HPV16/18检测的 1 000例患者作为观察对象。入选患者从未进行 LTS、阴道镜等相关检查及治疗,均有性生活史,且无子宫切除史,无宫颈鳞状上皮内病变史。年龄最小 16岁,最大 77岁,平均年龄 36.23岁。 对其中细胞学筛查阳性和临床高度怀疑宫颈病变的患者行阴道镜检查和镜下活组织病理检查。

2 材料选择 LTS液基细胞学检测试剂盒为珠海市丽拓发展有限公司生产,试剂盒组成均包括细胞收集瓶、标本采集刷、细胞处理基液、清洁液、离心管、载玻片。兔抗人 HPV16/18 E6抗体和羊抗兔 IgGHRP均购于美国 Santa公司。

3 标本采集 用无菌棉签擦去受试患者宫颈表面粘液,将 LTS标本采集刷插入颈管约 1cm,保持适当压力,顺时针旋转 5～8圈,取出细胞刷将刷头放入盛有 5ml LTS液基细胞保存液中。

4 LPT液基细胞学技术 保存液中的标本经涡式混匀器振荡混匀 5min,倒入加有 4 ml清洁液的离心管内,标记患者信息于管壁上,离心 10min,速度为 2 500r/min,将上清液倒回细胞保存液瓶内,加 2ml细胞处理基液振荡摇匀后吸 50ul滴在玻片上制成直径15mm的薄层涂片,自然干燥后 95%乙醇固定、巴氏染色、封片。将细胞保存液瓶内残液保存在 2ml的 EP管中做好标记,置于 4℃冰箱,用于提取 DN A。

5 免疫印记法检测宫颈液基细胞残液中HPV16/18的表达 将盛有样本的 2 ml EP管置于碎冰中,用超声波细胞粉碎机将其中的细胞打碎,10 000转 4℃离心 30min,取上清,编号,进行蛋白定量,保存在 4℃冰箱内备用。采用十二烷基硫酸钠-变性聚丙烯酰胺凝胶不连续缓冲系统,先后配 15%的分离胶和5%的浓缩胶;取蛋白样品,上样 2 0ul(约含蛋白32ug),电泳积层胶 80V、30min,分离胶 120V、70min;在转移缓冲液中进行电转移至聚偏氟乙烯膜上;将该膜在丽春红染液中染色 5min,观察电泳及转移效果;转移后放入 TBS中洗膜 10min,封入含有 5%BSA封闭液的塑料袋中 37℃缓慢摇动 1.5h;以含有 0.5%Tween-20的 TBS洗膜;将膜封入塑料袋中;加入一抗(1∶400)4℃过夜,洗膜,加二抗(1∶ 2000)孵育 2h;DAB显色 8 mi n。该膜上有显色带出现为阳性;若无显色带出现为阴性。

6 诊断标准 LT S诊断标准采用 2001年国际癌症协会 TBS诊断系统[1]。 LTS结果按 2001年国际癌症协会 TBS系统分类:正常范围;意义不明的不典型鳞状细胞和腺细胞 (ASCUS,AGUS);高度鳞状上皮病变、不典型鳞状细胞(ASCUS-H);低度鳞状上皮内病变(LSIL);高度鳞状上皮内病变(HSIL);鳞状上皮癌和腺癌。

7 统计学处理 所得数据采用 SPSS10.10软件进行 χ2检验。

结 果

1 L TS检测结果分析 LTS结果发现正常或炎症患者 870例,ASCUS 24例,ASCUS-H 26例,LSIL 61例,HSIL 19例。

2 细胞学异常患者病理诊断结果 LTS异常的130例患者行阴道镜下多点组织活检,病理诊断正常或炎性反应 71例,轻度不典型增生 CINI 18例,中度不典型增生 CINII 21例,重度不典型增生 CINIII 13例,浸润癌 2例,湿疣 5例。

3 HPV16/18感染与病理诊断的关系 见附表。130例 LTS结果异常患者中,进行 HPV16/18检测,结果显示,随病理级别的升高,HPV16/18感染率显著上升,差异有统计学意义 (P＜0.05)。

附表 HPV16/18感染与病理诊断的关系 [(例)%]

4 细胞学、病理学和 HPV16/18检测的比较对 LT S正常或炎症而 HPV16/18阳性,同时高度怀疑宫颈病变患者 65例进行阴道镜下多点组织活检,结果显示,正常或炎性反应 51例,CINI 9例,CINII 5例,未发现 CINIII及以上的病例。 LTS正常或炎症和 HPV16/18阳性患者中,宫颈病变的检出率为 21.5%,提示联合液基细胞学和 HPV16/18检测可提高宫颈早期癌变的检出率。

讨 论

宫颈癌是妇科最常见的恶性肿瘤,近年来宫颈癌的发病率呈年轻化的上升趋势。流行病学和生物学资料已证明人乳头瘤病毒(HPV)感染是宫颈癌及宫颈上皮内病变的主要病因[2],尤其是高危型 HPV16/18。但HPV感染多为一过性,常在 8～10月左右消失,只有一小部分发展为持续感染,持续携带 HPV才有可能引起宫颈上皮内病变和宫颈癌。因此检测 HPV对于宫颈病变的早期诊断,早期治疗意义重大。

液基细胞学检查是宫颈癌及癌前病变筛查的主要检查方法之一[3]。然而,液基细胞学是通过挖空细胞来诊断 HPV感染的,挖空细胞核周有空晕及易出现双核现象和异型性的原因影响观察,因此具有一定的局限性。免疫印迹法作为检测 HPV感染的常用方法,具有抗原性保存好、检测结果精确的优点。本研究利用 LTS液基细胞学检查后剩余的宫颈液基细胞残液进行免疫印记法 HPV检测。结果表明,LTS正常或炎症和HPV16/18阳性患者中,宫颈病变的检出率为 21.5%,提示联合 LTS液基细胞学和 HPV16/18检测可提高宫颈早期癌变的检出率。 LT S结果异常患者中,宫颈癌、CINⅢ、CINⅡ、CINⅠ的 HPV16/18阳性率分别为 100%、69.2%、33.3%、16.7%。体现了 HPV16/18的检出率随着宫颈病变的严重程度增加而增加。HPV16/18对筛查 CINⅡ、Ⅲ和早期宫颈癌的敏感度很高,能够把可高风险人群筛查出来。显示了 HPV16/18适合作为筛查宫颈高度病变的一种简便方法,可以筛查出高风险人群,并使带有病毒而目前细胞学正常的女性得以随访,从而降低宫颈癌的发生。若将 LTS液基细胞学检查与残液 HPV16/18检测联合起来可以弥补相互的不足,是一种高效而经济适用的宫颈癌前病变筛查方案,值得大力推广。

本文采用 LTS技术对液基细胞残液 HPV检测,在国内尚属首次。LTS液基细胞学检查是一种国产新型液基细胞检查技术,其制片质量好、经济适用、操作方便[4]。利用 L TS液基细胞残液进行免疫印记法HPV16/18检测结果准确、方便易行并能减低筛查的费用,是一种高效又经济的筛查方法。阴道镜下对可疑病灶进行活检是最后明确诊断的手段。因此对于HPV16/18和(或)LTS检查结果异常者,应进行阴道镜检查与宫颈活检,是最稳妥的宫颈癌筛查方案之一,可以把漏诊率降到最低[5]。但这一方案筛查的成本增加,也不是所有妇女都同意接受阴道镜检查,不适合作为常规筛查手段。

[1]陈丽宏,刘晓琴,杨春荣,等.液基细胞学联合高危型 HPV检测在宫颈疾病诊断中的应用[J].陕西医学杂志,2007,36(10):1377-1379.

[2]Petry KU,Menton S,Menton M,et al.Inclusion of HPV test ingin routi necervical cancer screeningfor woman above 29 years in Gemany:results for 8466 patients[J].Br J Cancer,2003,88(10):1570-1577.

[3]初 霞,张喜卿,王巧云.液基薄层细胞学和 HPV原位杂交在宫颈疾病诊断中的应用[J].实用医学杂志,2009,26(5):15-16.

[4]兰 淼,巩 丽,李艳红,等.两种液基细胞试剂盒对筛查早期宫颈癌应用价值的对比研究 [J].现代肿瘤医学,2010,18(12):2466-2468.

[5]岑坚敏,钱德英,黄志宏,等.阴道镜对宫颈上皮内瘤变的诊断价值 [J].中国实用妇科与产科杂志,2003,19:215-218.