婴幼儿喘息性疾病外周血嗜酸性粒细胞Caspase-3的表达及意义

杨晓丽，卢先锋，席秀琴

(山西省人民医院，山西太原 030012)

喘息是婴幼儿时期的常见症状。喘息性疾病是以喘息为主要症状、具有反复发作或以后可能反复发作为特点的数种呼吸系统疾病的总称[1]。主要是由于各种原因导致支气管反应性增高、支气管黏膜水肿，且分泌物增多、黏稠，管壁平滑肌收缩使气道发生可逆性痉挛和狭窄。常见的婴幼儿喘息性疾病包括毛细支气管炎、喘息性支气管炎和支气管哮喘，其发病率有逐年上升的趋势。喘息性婴幼儿的血中和气道分泌物中存在大量类似哮喘患儿所特有的炎性物质[2]。以嗜酸性粒细胞(Eosi-nophils，EOS)为主的炎性细胞浸润是变态反应性炎症的特点。作为变态反应性疾病，嗜酸性粒细胞介导的炎症在哮喘的发病过程中起着重要的作用[3]。本试验通过检测喘息性婴幼儿外周血中的嗜酸性粒细胞及其 Caspase-3的活性表达，探讨Caspase-3活性表达与嗜酸性粒细胞凋亡的关系，进而为婴幼儿喘息性疾病的防治提供可能的理论依据。

1 对象与方法

1.1 研究对象

选取2009年9月至2011年4月在山西省人民医院儿科住院治疗的2个月至3岁喘息性婴幼儿120例，男性68例，女性52例。除外先天性心脏病、结核感染及支气管异物等疾病引起的喘息。120例中27例支气管哮喘的诊断符合2004年中华医学会儿科分会呼吸学组制定的儿童支气管哮喘防治常规[1]，74例毛细支气管炎的诊断符合《实用儿科学》毛细支气管炎诊断标准，19例肺炎衣原体感染性肺炎的诊断符合《诸福棠实用儿科学》诊断标准[4]。2个月～1岁组45例，男性17例，女性28例，平均年龄(0.7±0.2)月;～2岁组35例，男性26例，女性9例，平均年龄(1.5±0.1)岁;～3岁组40例，男性25例，女性15例，平均年龄(2.4±0.3)岁。健康对照组30例，均为健康体检婴幼儿，男性16例，女性14例，年龄4个月～3岁，平均年龄(1.6±0.2)岁。所有婴幼儿均为足月出生，组间性别、年龄差异均无统计学意义(P＞0.05)，均获得其家长知情同意。

1.2 检测方法

所有入选患儿均取空腹静脉抗凝血2份，每份4mL，分别进行嗜酸性粒细胞计数及嗜酸性粒细胞Caspase-3 活性表达的检测[5]。

1.2.1 嗜酸性粒细胞的分离

静脉采血4mL(肝素抗凝)，加入4mL4.5%DextranT 500中，37℃ 30min沉淀红细胞，取含白细胞血浆层200 g离心10min，去除血小板，PBS液漂洗2次，400 g离心7min，用含5%小牛血清的 D-Hank＇s液制成2mL白细胞悬液，在37℃孵育30min，加入已加好1.100、1.090、1.085 等渗 Percoll密度液各2mL的离心管(1 000 g离心30min)中，取1.100、1.090 处细胞，然后用D-Hank＇s液漂洗2次即为所获EOS。将获取的EOS倒入玻璃匀浆管中，用匀浆介质冲洗，于4℃制成10%的匀浆，3 000 r/min离心15min，取上清液，用于Caspase-3活性的检测。

1.2.2 血清嗜酸性粒细胞计数及其Caspase-3活性表达的检测

血清嗜酸性粒细胞计数由(XE-2100全自动血液分析仪检测)日本东亚公司生产。嗜酸性粒细胞Caspase-3活性表达的检测，采用Caspase-3活性检测试剂盒检测(上海生研生物科技有限公司生产)。

1.3 统计学处理

应用SPSS13.0软件进行统计学检验分析，统计学处理结果计量数据用±s表示，组间两两比较均采用秩和检验，以P﹤0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

各喘息组外周血EOS计数与对照组比较，各喘息组外周血EOS计数均高于对照组(均P＜0.05)，各喘息组两两之间差异无统计学意义(均P＞0.05)，见表1。各喘息组外周血嗜酸性粒细胞Caspase-3活性表达与对照组比较均低于对照组(均P＜0.05)，各喘息组两两之间差异无统计学意义(均P＞0.05)，见表1。

表1 各组EOS计数及Caspase-3活性表达(±s)Table 1 EOS Count and Activity Expression of Caspase-3 in Each Group(±s)

表1 各组EOS计数及Caspase-3活性表达(±s)Table 1 EOS Count and Activity Expression of Caspase-3 in Each Group(±s)

组别 EOS计数(×109/L)Caspase-3/(mmol·L-1)对照组0.082 5±0.251 6 16.42±1.47 2个月～1岁 1.108 2±0.245 1 6.56±1.85～2岁 1.081 4±0.156 2 7.42±2.01～3岁 1.114 2±0.223 8 6.38±1.74 H值4.015 2 13.021 6 P值0.012 4 0.007

3 讨论

婴幼儿喘息性疾病是婴幼儿时期呼吸系统常见疾病，婴幼儿喘息的主要临床表现是气喘、咳嗽、呼吸困难、肺部常可闻及哮鸣音及湿啰音。2003年，Taussig等[6]报导了Tucson儿童的呼吸研究，对1 246例出生后的婴儿进行随访观察，内容包括危险因素、急性呼吸道感染和慢性肺疾病等因素，将婴幼儿喘息分为三种类型:一过性的早期喘息、非过敏性的喘息和晚发的喘息及哮喘。

由于婴幼儿呼吸系统及免疫系统正处于发育阶段，婴幼儿时期某些病原体的感染，很可能影响到机体的免疫系统及呼吸系统的发育，易发生喘息，甚至发展为哮喘[7]。以往认为，在小儿时期，喘息性疾病多与病毒或细菌感染有关，但近年研究显示喘息性疾病临床及病理都有类似哮喘的表现，此类患儿的血中和气道分泌物中存在大量类似哮喘患儿所特有的炎性物质，可致支气管平滑肌痉挛，血管舒张致血浆渗出及水肿[2]。

外周血嗜酸性粒细胞是变态反应疾病如支气管哮喘、过敏性鼻炎中的一种关键效应细胞[8]，嗜酸性粒细胞可以释放多种炎性介质和毒性蛋白，在婴幼儿喘息形成和发展过程中起重要作用。

细胞凋亡是一个十分复杂的过程，具有复杂性、多样性，不同应激、不同细胞存在不同的信号转导途径。哺乳动物维持正常的生理活动需要多种信号转导途径，这些信号通路之间相互作用，在体内构成一个复杂的信号网络，这种信号网络有利于维持机体细胞对信号刺激反应的完整性和协调性[9]。Caspase分为三大类:凋亡启动因子、凋亡执行因子和炎症介导因子，构成了级联放大效应。凋亡启动因子在级联反应的上游，包括Caspase-2、Caspase-8等，能在其他蛋白辅助下发生自我活化并识别和激活下游的Caspase而诱发凋亡[10，11]。凋亡执行因子在级联反应的下游，包括Caspase-3、Caspase-6和Caspase-7等，作用于其特异性底物并导致细胞凋亡，Caspase-3被认为是各种凋亡刺激因子激活的 Caspase家族中的关键蛋白酶，是Caspase家族中的最重要的凋亡执行者之一，是细胞凋亡过程中的主要效应因子，它的活化是凋亡进入不可逆阶段的标志[12]。

本研究发现，3岁以下婴幼儿喘息性疾病过程中，其外周血嗜酸性粒细胞计数高于健康婴幼儿外周血嗜酸性粒细胞计数，表明嗜酸性粒细胞参与了婴幼儿喘息性疾病的发生、发展过程。通过测定喘息性婴幼儿嗜酸性粒细胞中Caspase-3的活性发现，喘息性婴幼儿嗜酸性粒细胞中Caspase-3的活性低于健康婴幼儿嗜酸性粒细胞中Caspase-3的活性，提示在喘息性婴幼儿嗜酸性粒细胞凋亡过程中，可能存在某种因素抑制了Caspase凋亡因子的激活，从而延缓了嗜酸性粒细胞的凋亡，导致外周血嗜酸性粒细胞升高，进而使嗜酸性粒细胞参与婴幼儿喘息性疾病的发生发展过程。抑制Caspase凋亡因子激活的原因仍待进一步研究，喘息性婴幼儿外周血嗜酸性粒细胞的凋亡抑制，除了Caspase-3活化受到抑制外，可能还存在其他凋亡抑制作用途径，有待于今后进一步研究。

[1] 中华医学会儿科学分会呼吸学组.儿童支气管哮喘防治常规(试行)[J].中华儿科杂志，2004，42(2):100-104.

[2] 刘宏阁.婴幼儿喘息因素探讨及诊治分析[J].中国实用医药，2009，8(4):100.

[3] 吴小军，聂汉祥，丁续红，等.嗜酸粒细胞和嗜酸粒细胞阳离子蛋白在气道高反应性患者诊断中的价值[J].武汉大学学报，2011，32(2):216.

[4] 胡亚美，江载芳.诸福棠实用儿科学[M].北京:人民卫生出版社，2000.

[5] 周 斌，蔡绍曦，赵海金，等.适合膜片钳试验的一种外周血嗜酸性粒细胞分离法[J].第一军医大学学报，2005，25(7):782-783.

[6] Taussig L M，Wright A L，Hoberg C J，et al.Tucson Children.Respiratory Study:1980 to Present[J].J Allergy Clin Immunol，2003，111(4):661-675.

[7] 郝创利.1990年，2000年苏州市地区儿童哮喘患病情况调查对比分析[J].临床儿科杂志，2003，21(9):543-544.

[8] Xu JS，Cai SX，Zou F，et al.Cloning of Differentially Expressed Genes of Eosinophils from Asthmatic Patients by Suppression Subtractive Hybridization[J].J First Mil Med Univ/Di Yi Jun Yi Da Xue Xue Bao，2004，24(5):509-513.

[9] 梁先敏.Caspase和JNKPSAPK、p38 MAPK与细胞凋亡[J].国外医学·卫生学分册，2008，35(1):9.

[10] Scatena R，Bottoni P，Botta G，et al.The Role of Mitochondria in Pharmacotoxicology:A Reevaluation of an Old，Newly Emerging Topic[J].Am J Physiol Cell Physiol，2007，293:C12-21.

[11] HackeRG，Paschen SA.The Rapeutic Targets in the Mitochondrial Apoptotic Pathway[J].Expert Opin TheRTargets，2007，11:515-526.

[12] Cryns V，Yuan J.Protease to Die For[J].Genes Dev，1998，12(11):1551-1570.