反相高效液相色谱法测定白芷提取分离物中欧前胡素含量

胡大强，侯丽娜，孟德胜，陈 亮，徐 靖

白芷为伞形科植物白芷 Angelica dahurica(Fisch.ex Hoffm.)Benth.et Hook.f.的干燥根，味辛，性温，归肺、胃、大肠经，芳香升散，有祛病除湿、排脓生肌、活血止痛、抗炎、抑制病原微生物、抗肿瘤、保肝等多种药理活性，近年来发现其具有清除自由基、增白及治疗白癜风的作用。白芷的主要有效成分为香豆素类化合物，其中欧前胡素的含量通常采用薄层色谱法测定。在白芷经乙醇提取、大孔吸附树脂分离后得到主要含欧前胡素的乙醇溶液基础上，笔者采用高效液相色谱法测定其中欧前胡素的含量，现报道如下。

1 仪器与试药

Agilent 1200 LC型高效液相色谱仪，包括G 1329 A标准型自动进样器、G 1314 B型VWD检测器(美国安捷伦科技有限公司)。欧前胡素对照品(中国药品生物制品检定所，批号为110826－200712);白芷(太极集团重庆中药饮片厂有限公司，批号为090212);甲醇(分析纯，重庆川东化工有限公司，批号为0081104);甲醇(色谱纯，西班牙Scharlau Chemie S.A.公司);药用乙醇(四川金鹰实业有限公司，批号为090209)。

2 方法与结果

2.1 色谱条件[1－2]

色谱柱:Zorbax Eclipse XDB －C18柱(150 mm ×4.6 mm，7μm);流动相:0～6 min甲醇－水(65∶35)，6～15 min甲醇－水(55∶45)，15～25 min甲醇－水(65∶35);流速:1 mL/min;检测波长:302 nm;柱温:室温;进样量:20μL;理论板数为3 600。色谱图见图1。

2.2 溶液制备[3－4]

乙醇回流提取白芷总香豆素后，经大孔吸附树脂柱分离得到欧前胡素含量较高的供试品溶液，按此方法制备供试品溶液3批。精密称取欧前胡素对照品0.033 g，置10 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，摇匀。取上述溶液1.0 mL，置50 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，得质量浓度为660μg/mL的对照品贮备液。

图1 高效液相色谱图

2.3 方法学考察

线性关系考察:分别精密吸取2.2项下对照品贮备液1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mL，分别置于 10 mL 容量瓶中，甲醇定容至刻度，摇匀，微孔滤膜过滤后，按2.1项下色谱条件测定。以峰面积积分值(Y)对欧前胡素质量浓度(X)进行线性回归，得回归方程 Y=0.014 2 X+0.006 0，r=0.999 8(n=5)。结果表明，欧前胡素质量浓度在66～330μg/mL范围内与峰面积线性关系良好。

精密度试验:取“线性关系考察”项下质量浓度为198μg/mL的欧前胡素对照品溶液，分别于 0，0.5，1.0，2.0，4.0 h 时依法测定，结果的 RSD=0.59%(n=5)。

加样回收试验:在3个已知含量的欧前胡素供试品溶液1.0 mL的 10 mL 容量瓶中，分别精密加入欧前胡素贮备液 1.0，2.0，4.0 mL，甲醇定容至刻度，摇匀，即配成低、中、高质量浓度的欧前胡素溶液，按2.1项下的色谱条件测定，结果见表1。

2.4 样品含量测定

取制备的3批欧前胡素提取物供试品溶液，分别精密吸取1.0 mL，水浴蒸干，用甲醇溶解后转移至25 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，再精密吸取2.0 mL至10 mL容量瓶中，甲醇定容至刻度，摇匀，微孔滤膜过滤后依法测定。结果3批供试品溶液中欧前胡素的质量浓度分别为1.01，0.98，0.92 g/L。

表1 加样回收试验结果(n=15)

3 讨论

曾参照2005年版《中国药典》中的高效液相色谱法，但流动相中甲醇比例低，导致出峰时间过长，而供试品溶液杂峰较少，故增加甲醇比例;甲醇比例过高会导致欧前胡素峰与周围峰分离度不高，为节省时间，选用梯度的流动相洗脱，即0～6 min甲醇－水(65∶35)，6～15 min甲醇 －水(55∶45)，15～25 min甲醇 －水(65∶35)。欧前胡素峰的理论板数、保留时间较理想，峰对称性也符合要求。

[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部)[M].北京:化学工业出版社，2005:59.

[2]李立荣，雷玉萍，殷 帅.高效液相色谱法测定通窍鼻炎片中欧前胡素含量[J].中南药学，2006，12(4):434－436.

[3]杨 云，冯卫星.中药化学成分提取与分离手册[M].北京:中国中医药出版社，1998:95－99.

[4]何芳辉，尹蓉莉，刘 扬，等.大孔树脂纯化白芷总香豆素工艺研究[J].时珍国医国药，2008，19(3):710－712.