HPLC法同时测定注射用头孢他啶和精氨酸的含量

覃业语

（海南省人民医院药学部，海南 海口 570311）

头孢他啶（Ceftazidime）又名头孢噻甲羧肟，是第三代头孢菌素，抗菌谱广，抗菌活性强，并对多种β-内酰胺酶高度稳定，其最大特点是对绿脓杆菌的抗菌活性特别强，优于目前临床使用的所有头孢菌素和广谱青霉素类抗生素，在临床应用十分广泛。

头孢他啶本身为酸性物质，pH值3.0～4.0，且具有一定的疏水性，难溶于酸性溶液，pH近中性条件下溶解度高。而临床上常用作溶解、稀释剂的生理盐水、5%葡萄糖液的pH值分别为4.5～7.0、3.2～5.5，均偏酸性，所以以往都采用在头孢他啶制剂中加入碳酸钠作为助溶剂，调节pH值利于头孢他啶溶解。经过长期临床使用发现碳酸钠作为助溶剂有很多缺点[1]，如使用以碳酸钠作为助溶剂的头孢他啶会增加心脏病、高血压、肾病、肝腹水等需要限制钠离子摄入的患者用药风险性，另外以碳酸钠作为助溶剂的头孢他啶在稀释时会产生CO2气体，如果排气操作不当可能会污染药液，在输液过程中CO2溶出产生气泡使气体进入患者血液内可能形成气体栓塞，如阻塞出现在心、脑主要血管对患者会造成很大危险。用有机化合物精氨酸代替碳酸钠作为头孢他啶助溶剂，用药安全性和稳定性都有很大的提高。

中国药典2005年版二部采用高效液相色普法(HPLC)测定头孢他啶和碳酸钠的含量[2]。本文建立了HPLC外标法，对注射用头孢他啶(含精氨酸)可同时测定头孢他啶、精氨酸的含量，被测组分能较好地分离，线性关系良好，回收率满意。该法专属性好、快速、准确，适用于原料合成及制剂分装前生产过程的质量监控。

1 仪器、药品及试剂

Agilent 1100 series高效液相色谱仪(包括G1314A VWD检测器，G1311A Quat Pump泵，G1329A自动进样器，G1314A可变紫外线分光光度检测器，真空脱气机和Agilent化学工作站)，注射用头孢他啶样品(规格1.5 g，批号为050601 050602 050603，由深圳制药厂提供；头孢他啶对照品(批号0484-9901)(含量为84.9%)、精氨酸含量对照品（批号140685-200401）均由中国药品生物制品检定所提供；乙腈，色谱纯；其余试剂均为分析纯。

2 色谱条件选择

2.1 检测波长的选择 取头孢他啶和精氨酸对照品适量，加流动相溶解，制成每1 ml含约10 μg的溶液，在200～400 nm处扫描其紫外吸收。结果显示：头孢他啶在256 nm和209 nm波长处有最大吸收，精氨酸在206 nm有最大吸收，故选择206 nm作为本品有关物质的检测波长。

2.2 柱子的选择 根据柱子的极性不同我们试验了C18＞C8＞苯基柱PH-3＞苯基柱PH-2（①依利特Hypersil C18 10 μm 4.6 mm ×250 mm；②Agilent Eclipse DB-C8 4.6 mm×150 mm ；③Shimadzu vp-ODS150L×4.6mm 5012136；④Inertsil 1LI05521 pH-3 5 μm4.6 mm×250 mm；⑤PLenomen 250 mm×4.6 mm；⑥Thermo Hypersil pHenyl 2 Column 250 mm×4.6 mm5 μm），结果表明苯基柱2的分离效果优于其他柱。

2.3 流动相组分和组分比例的选择[3-5]（1）以磷酸盐缓冲液-乙腈88：12为流动相,流速1.0 ml/min，取对照溶液20 μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。结果表明：磷酸盐缓冲液-乙腈仅能检测到一个峰（精氨酸），另一个峰（头孢他啶）未被检出。（2）以醋酸盐缓冲液-甲醇88：12为流动相，流速1.0 ml/min，取对照溶液20 μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。结果表明：磷酸盐缓冲液-乙腈仅能检测到一个峰（头孢他啶），另一个峰（精氨酸）未被检出。（3）以醋酸盐缓冲液-乙腈88：12为流动相，流速1.0 ml/min，取对照溶液20 μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。结果表明：醋酸盐缓冲液-乙腈能检测到二个峰。但精氨酸的保留时间过短与溶剂峰分离不好，故减小流动相有机相的比例，选择醋酸盐缓冲液-乙腈（95：5）溶液作为本品含量检测的流动相，分离度较好。

2.4 流动相pH的选择 以醋酸盐缓冲液-乙腈（95：5）溶液作为流动相，用稀醋酸或1 mol/L氢氧化钠溶液调节其pH值，分别选择pH值为5.0、7.0和8.5的流动相，流速1.0 ml/min，取对照溶液20 μl注入色谱仪，记录色谱图，考察三者的保留时间T和分离度R。结果表明：以醋酸盐缓冲液-乙腈（95：5）溶液为流动相，随着pH值的增加，pH 5.0时两种物质峰保留时间较为理想，而醋酸盐缓冲液-乙腈（95：5）溶液的pH值约为7.0或8.5时，只检测到头孢他啶峰，而精氨酸的峰未检测到。选择醋酸盐缓冲液-乙腈（95：5）溶液pH为5.0时作流动相作为本品含量的流动相。

2.5 通过以上实验确定色谱条件 色谱柱：ThermoHypersilPhenyl-2column(250mm×4.6mm 5μm)；流动相：乙腈-醋酸盐缓冲液(称取醋酸钠0.7 g和冰醋酸0.15 g加水稀释到1 000 ml，用0.1 mol/L稀冰醋酸或1 mol/L氢氧化钠调节pH值到（5.0±0.1)(5：95)；流速：1.0 ml/min；检测波长：206 nm；柱温30℃。

3 系统适用性实验

3.1 对照溶液的配制 在本实验流动相系统下，精密称取头孢他啶对照品0.027 08 g、精氨酸对照品0.012 17 g，置25 ml容量瓶中，用流动相超声溶解，混匀，稀释到刻度，取其溶液20 μl，进样，色谱图见图1。在该色谱条件下，对照品头孢他啶与精氨酸的混合溶液两者的分离度大于1.5，保留时间相对满意，头孢他啶与助溶剂精氨酸能较好地分离，系统适应性良好，见表1。

图1 对照混合溶液色谱图

表1 系统适应性结果

3.2 样品溶液的制备 取头孢他啶样品，精密称取0.019 64 g，置于25 ml容量瓶中，用流动相溶解并稀释至刻度，取其溶液20 μl，进样，色谱图见图2。

图2 样品溶液色谱图

4 方法学考察

4.1 线性关系考察 分别精密称取头孢他啶对照品和精氨酸含量对照品适量，用流动相分别制成含头孢拉定0.09196、0.229 9、0.459 8、0.6897、0.919 6 mg/ml，含精氨酸0.04868、0.121 7、0.243 4、0.365 1、0.486 8 mg/ml的混合溶液，精密量取上述混合溶液20 μl，进样，以各样品浓度对峰面积回归，得头孢他啶和精氨酸回归方程分别为：

结果表明头孢拉定、精氨酸分别在0.091 96～0.919 6 mg/ml和0.04868～0.486 8 mg/ml范围内线性关系良好。

4.2 精密度试验 取头孢他啶和精氨酸对照品混合溶液，分别连续进样6次，以峰面积计算，相对标准偏差(RSD)分别为0.05%和0.74%。日内和日间精密度RSD分别为0.08%～0.15%和0.29%～0.82%。

4.3 重复性实验 取同一批样品，按含量测定方法平行配制5份，分别测定，头孢他啶和精氨酸测定结果的RSD分别为0.47%和0.90%。不同时间测试，头孢他啶和精氨酸的测定结果的RSD分别为0.71%(n=5)、1.21%(n=5)。

4.4 稳定性实验 在本实验条件下样品溶液室温放置，分别于0 h、1 h、2 h 、4 h、15 h进样，测定峰面积，头孢他啶RSD为0.64%(n=5)，精氨酸RSD为0.87%(n=5)。

4.5 加样回收试验 采用加样回收法，取已知含量的样品溶液，分别精密加入头孢他啶对照品1.5 mg、2.5 mg、3.5 mg，精氨酸对照品 0.75 mg、1.25 mg、2.75 mg，按样品测定法测定，计算加样回收率及RSD(见表 2)。

表2 加样回收试验（%）

5 样品测定

分别精密称取不同批号头孢他啶样品约37 mg，置于50 ml容量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀做为样品溶液，取20µl进样，结果见表3。

表3 样品测定（%）

6 讨论

头孢他啶分别在256 nm和209 nm附近有吸收，同时精氨酸在206 nm附近有最大吸收，故实验波长选择206 nm。但是所选的波长吸收为紫外检测器的边缘吸收，实验过程中应注意基线的稳定性。

流动相采用极性较大的乙腈，本文试验了不同配比的乙腈-醋酸盐缓冲液组成的流动相分离效果，随着乙腈的比例不断减少，各组份保留时间相应提高，我们选择乙腈-醋酸盐缓冲液配比为5：95时为实验流动相的配比，保留时间也相对满意，且各组分间分离度均大于1.5，头孢他啶与助溶剂精氨酸能较好地分离。

[1]詹少锦,刘蓉惠,卞益民.头孢他啶不同助溶剂之比较[J].广东药学杂志,2005,15(3)：68-69.

[2]中华人民共和国国家药典委员会.中国药典[S].2005年版,二部附录.北京：化学工业出版社,2005：234.

[3]胡昌勤.高效液相色谱法在抗生素质控分析中的应用(下册)[M].北京：气象出版社,2001：48.

[4]方娟娟,余卫平,邢艳霞,等.高效液相色谱法测定人血清中头孢他啶的浓度[J].东南大学学报（医学版）,2004,23(6)：388-390.

[5]彭 军,任 耘,孙 悦.高效液相色谱法测定头孢他啶注射剂的含量[J].中国医院药学杂志,2001,21(10)：601-602.