拉米夫定对慢性乙型肝炎患者CD28表达的影响

涂远航，马 勇，谷 旻

1)解放军第123医院肝病中心 蚌埠233015 2)解放军第123医院检验科蚌埠233015

慢性乙型肝炎(CHB)的治疗，抗病毒是关键。但CHB患者对抗病毒药物的反应差异较大。目前普遍认为，T淋巴细胞介导的细胞免疫对乙型肝炎病毒(HBV)的清除起关键作用，T淋巴细胞表面协同刺激分子及其配体的正常表达是其活化和发挥功能的关键因素。目前关于CD28在乙型肝炎免疫耐受中的作用研究［1-2］较多，但CD28的表达与抗病毒疗效之间的关系，国内外鲜见报道。该研究检测了CHB患者外周血T淋巴细胞CD28的表达，以分析其表达与抗病毒疗效的关系。

1 对象与方法

1.1 研究对象 42例CHB患者均为解放军第123医院肝病中心2006年5月至2010年6月收治的住院患者，男36例，女6例;年龄15～54(30±10)岁。所有病例均符合文献［3］的诊断标准。所有病例均排除HBV相关性疾病，合并甲、丙、丁、戊型肝炎病毒感染者及自身免疫相关疾病者。入选前均未接受过抗病毒治疗和免疫治疗。入选后均给予拉米夫定片100 mg口服，1次/d，疗程3 a，治疗期间定期监测ALT、AST、胆红素、白蛋白，以及病毒学标志包括HBeAg、抗-HBe和HBV DNA等。根据治疗后的应答情况，分为完全应答组、部分应答组和无应答组［3］。完全应答组(n=11):HBeAg阳性 CHB患者，治疗后 ALT恢复正常，HBV DNA检测不出(PCR法)和HBeAg血清学转换;HBeAg阴性CHB患者，治疗后ALT恢复正常，HBV DNA检测不出(PCR法)。部分应答组(n=21):介于完全应答与无应答之间。如HBeAg阳性CHB患者，治疗后ALT恢复正常，HBV DNA＜105拷贝/mL，但无HBeAg血清学转换。无应答组(n=10):未达到以上应答者。

1.2 CD28表达情况的检测 ①外周血单个核细胞(PBMC)的分离:在被检测者抗凝血中加入等体积Hank’s液，混合均匀。取一个10 mL无菌离心管，加入4 mL Ficoll液于离心管底部，用移液管将稀释的血液缓慢加入到Ficoll液上层，此时试管内的液体分为2层，上层为稀释的血液，下层为Ficoll液。静置10 min后1 700 r/min离心20 min。离心后，上清液分为5层，分别为血浆层、PBMC层、Ficoll液层、粒细胞层和红细胞层。弃去血浆，将PBMC层转移到另外一个无菌试管中，用Hank’s液洗涤，1 700 r/min离心，弃上清，共洗涤3次，获得PBMC。②外周血淋巴细胞CD4、CD8、CD28的检测:采用荧光素二抗体标记法结合流式细胞仪检测，取专用试管依次加入 PBMC(浓度1×106mL－1)、CD4/CD28、CD8/CD28单克隆抗体各20 μL，混匀置暗处室温放置30 min，每管再加 PBS 0.5 mL混匀置4℃待测，流式细胞仪测定分析采用BD公司GENQUES软件(每次获取10 000个细胞统计结果)。

1.3 统计学处理 应用SPSS 11.5进行统计学分析，采用单因素方差分析比较各组治疗前后CD4+CD28+和CD8+CD28+变化量的差异，两两比较采用 LSD-t检验，检验水准 α =0.05。

2 结果

3组患者抗病毒治疗前后CD28表达情况比较见表1。

表1 3组患者抗病毒治疗前后CD28表达情况比较 %

3 讨论

拉米夫定是目前临床抗病毒治疗的一线药物之一，它能显著抑制HBV复制，改善肝脏生化功能和肝组织学病变。Yuen等［4］的研究结果表明，CHB患者长期服用拉米夫定治疗可明显降低肝硬化和肝癌发生率。虽然多数CHB患者对拉米夫定反应良好，但仍有部分患者经拉米夫定治疗后应答不佳，甚至无应答。因此，如何提高CHB患者对抗病毒治疗的应答率，是目前临床医生关注的热点问题。

目前已经明确，T淋巴细胞在清除病毒的过程中作用十分关键，静止 T细胞必须接受抗原提呈细胞提呈的双信号才能活化，第一信号是抗原特异性的;第二信号是由T细胞上的CD28与抗原提呈细胞上的B7分子结合而提供的。只有两个信号同时存在时，T细胞开始增殖并分泌相应细胞因子。若没有CD28提供第二信号，T细胞识别抗原后不能充分活化并表现效应功能，则导致 T细胞无能。Hara等［5］研究发现，通过同时阻断 CD28和诱导性协同刺激分子，可使淋巴细胞活性失能;Fan等［6］研究发现，通过阻断 CD28/B7可抑制 T细胞活化，并能诱导免疫耐受。CHB患者T淋巴细胞表面CD28分子数量减少，可能是病毒难以清除的原因之一［7-8］。作者观察了CHB患者服用拉米夫定抗病毒治疗前后细胞表面CD28的表达情况，结果显示对拉米夫定产生完全应答的患者，在治疗之前体内即有较高水平的CD28表达，而无应答者体内CD28表达则较低。这说明CD28的高表达可有效提高拉米夫定抗病毒疗效，T淋巴细胞表面CD28的表达水平与患者对拉米夫定的应答有关，可作为拉米夫定疗效预测的指标。拉米夫定无免疫调节作用，但拉米夫定治疗过程中却可能导致患者免疫功能的变化，赵红霞等［9］研究发现，拉米夫定抗病毒治疗变异后机体出现免疫功能改变，并推测这种改变可能与治疗后病毒种群变化有关。该实验中，各组患者经拉米夫定治疗后，其细胞表面CD28表达均较治疗前提高，表明拉米夫定治疗后机体细胞免疫功能有一定改善，可能与体内病毒载量减少，病毒血症对机体的免疫抑制作用得到缓解有关［10］。

理想的抗病毒方案应该能够激活足够的免疫细胞，但尽可能减少肝细胞的损伤，并能中止病毒持续的感染。而CD28则类似一个枢纽，与B7家族分子等构成精密调控免疫反应的网络，在保证机体体内免疫稳态的同时，对外来抗原产生特异应答［11］。如何有效上调体内T淋巴细胞表面CD28的表达，充分激活T淋巴细胞，对于CHB患者的抗病毒治疗有重要意义，值得进一步探讨。

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