口腔鳞状细胞癌组织的拉曼光谱观察

付 莉，刁振琦，刘健峰，饶凤飞，张建民，唐伟跃#

1)郑州铁路职业技术学院医学基础部病理学教研室 郑州450052 2)郑州大学物理工程学院基础物理教学中心 郑州450001

口腔鳞状细胞癌(oral squamous cell carcinoma，OSCC)是发生在口腔黏膜最常见的恶性肿瘤，位居全身恶性肿瘤发病率的前10位，约占头颈部恶性肿瘤的40%［1］，是威胁人类健康的主要疾病之一。目前患者治疗后的生存率无明显改善，术后转移和复发是死亡的主要原因，根本原因在于早期诊断方法匮乏，错失了治疗的最佳时机［2］。拉曼光谱是一种简便灵敏的光谱分析新技术，可以在分子水平上揭示癌细胞组织结构与正常细胞组织结构之间的差异，通过癌变组织和正常器官组织拉曼光谱的对比研究，发现反映改变的特征标志光谱。近年来拉曼光谱技术在细胞的结构、功能及细胞凋亡等方面的研究取得了迅速发展，它还能在一定程度上反映细胞内部蛋白质、核酸、脂类以及碳水化合物的成分、构象和含量变化［3］，从而使其在早期癌症诊断中发挥重要作用。作者利用激光共聚焦显微拉曼光谱仪对口腔正常黏膜组织和OSCC组织标本进行测定，以期发现正常口腔黏膜组织、OSCC组织的拉曼光谱在散射强度和谱线位置上存在的差异，为应用拉曼光谱技术早期诊断口腔黏膜恶性病变奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 标本来源 32例OSCC组织标本取自郑州大学第一和第五附属医院2008年1月至2009年12月的手术切除标本，10例正常口腔黏膜组织标本取自同期郑州市口腔医院的正常口腔黏膜组织的标本，均知情同意。其中男3例，女7例，年龄39～64岁，中位年龄49岁。全部42例病例术前均无放化疗及其他治疗史。32例OSCC均经病理证实，其中男19例，女13例，年龄21～80岁，中位年龄56岁;原发部位:舌12例，颊10例，牙龈6例，口底4例;18例有深层浸润(肌层、骨质或深层腺体)，14例有浅层浸润(黏膜及黏膜下层);组织学分级:Ⅰ级21例，Ⅱ级11例。

1.2 拉曼光谱仪检测 标本放入－22℃恒冷箱中迅速冷冻2 min，置于切片机做冰冻切片，厚1.0 mm，切出的组织切片直接附贴于清洗过的载玻片上，做好标记，晾干后置于激光共聚焦显微拉曼光谱仪下进行光谱采集。激光共聚焦显微拉曼光谱仪(英国Renishaw公司生产)参数设定:激发波长514 nm，光谱扫描范围500～2 000 cm－1，扫描时间20 s，采集次数1次。测试条件为室温，相对湿度(40±5)%。

1.3 观测指标 观察经mathlab2009处理后典型的拉曼谱图。对拉曼特征峰进行谱带指认，分别归属如下:1 085 cm－1附近属于核酸中磷酸基团的振动峰;1 134 cm－1附近为蛋白质 C=C伸缩振动;1 294 cm－1附近为蛋白质酰胺Ⅱ的C-O键伸缩振动;1 417和1 438 cm－1附近为CH2剪裁振动;1 459 cm－1附近为 C-H 弯曲振动［4］。

2 结果

正常口腔黏膜组织和OSCC组织切片600～2 000 cm－1波段内的吸收峰主要集中在1 000～1 600 cm－1范围内，拉曼光谱图见图1。正常口腔黏膜组织和OSCC组织切片的拉曼光谱谱带频移比较见表1。

图1 2种组织的拉曼光谱图

表1 2种组织切片的拉曼光谱频移比较 cm－1

3 讨论

正常组织与癌变组织的谱图在峰频移和峰强度方面表现出了差异性［5］，体现了在癌变组织中细胞形态和组织结构发生的变化，该研究结果显示，谱图的差别主要为:①口腔正常黏膜组织和OSCC组织切片的拉曼光谱相对强度存在差异，癌细胞胞核大，有时还会出现双核或多核，因此对应的拉曼光谱相对强度强。②口腔正常黏膜组织1 085 cm－1的拉曼峰，在OSCC组织中发生4 cm－1的蓝移，说明磷酸基团在癌变的变化过程中遭到破坏，此频移较大，可以作为鉴别口腔正常黏膜组织和OSCC组织的重要依据。在对其他肿瘤组织的拉曼光谱研究［6］中也发现该谱带有向高波数移动的现象。②正常黏膜组织的1 134 cm－1峰，在 OSCC组织中发生2 cm－1的蓝移，可能与组织在癌变过程中C=C键的张力发生改变有关［7］。④口腔正常黏膜组织归属于蛋白质酰胺Ⅱ的C-O键伸缩振动的1 294 cm－1峰，在癌变组织中移动到了1 296 cm－1;1 417 cm－1的CH2剪裁振动在OSCC组织的切片中移动到了1 419 cm－1附近。说明癌变组织在一定程度上改变了该成分的结构［8］，癌变组织的核酸和蛋白质均发生了变化。从而导致癌变组织不同于正常黏膜组织的拉曼谱线。⑤正常黏膜组织和OSCC组织切片的拉曼峰1 438和1 459 cm－1均没有产生频移，能否让其为拉曼谱的内标与其他各谱线相对强度和谱线位置做对比，找出相应的规律，有待进一步研究。

口腔正常黏膜组织和OSCC组织切片拉曼谱图的这些变化表明组织细胞在癌变过程中，其构型、构象和数量上发生了变化;磷酸基团在癌变的变化过程中遭到破坏;C=C键的张力发生改变;核酸和蛋白质均发生了变化。以上结果表明激光显微拉曼光谱法在揭示OSCC组织的发生、发展规律及其诊断的基础研究中有着良好的前景。

［1］邱蔚六.口腔颌面外科学［M］.3版.北京:人民卫生出版社，1995:259

［2］李一，文志宁，李龙江，等.口腔鳞状细胞癌近红外拉曼光谱特征及其诊断价值研究［J］.华西口腔医学杂志，2010，28(1):61

［3］齐健，郭郑元，张广水，等.利用拉曼光谱研究60Co γ射线对EC9706细胞的辐射损伤［J］.光谱学与光谱分析，2009，29(7):1896

［4］唐伟跃，刘婉华，孙雷明，等.肺癌切片的拉曼光谱分析［J］.激光杂志，2007，28(3):91

［5］张广水，陈长青，齐健，等.EC9706细胞经不同剂量X射线辐照后的拉曼光谱［J］.中国激光，2009，36(2):509

［6］佟倜，叶松，安利民，等.鳞癌及其癌旁组织的共聚焦激光拉曼光谱分析［J］.吉林大学学报:医学版，2004，30(5):813

［7］Kah JC，Kho KW，Lee CG，et al.Early diagnosis of oral cancer based on the surface plasmon resonance of gold nanoparticles［J］.Int J Nanomedicine，2007，2(4):785

［8］Oliveira AP，Bitar RA，Silveira L，et al.Near-infrared Raman spectroscopy for oral carcinoma diagnosis［J］.Photomed Laser Surg，2006，24(3):348