机动车尾气有机提取物对HepG2细胞的遗传毒性

郭海玲，夏向群，杨海燕

1)北京中医药大学东直门医院护理部北京100700 2)河南省疾病预防控制中心环境卫生科郑州450016 3)郑州大学公共卫生学院流行病学教研室郑州450001

随着经济的发展，城市机动车数量呈直线增长，机动车排放的尾气已成为现今空气污染的主要来源。研究［1］表明机动车尾气中含有大量的致突变和(或)致癌作用的化学物质，如多环芳烃等。动物实验［2］结果显示机动车颗粒物有机提取物经大鼠皮肤染毒能引起致癌效应。由此引发人们对机动车尾气致癌作用的广泛研究［3-5］。双核细胞微核试验和彗星试验是广泛应用于化学物遗传毒性筛检的测试方法，但关于机动车尾气对体外培养的HepG2细胞双核微核(cytokinesis-block micronucleus，CBMN)和彗星尾距的影响目前国内还未见报道。为此，作者应用CBMN试验和彗星试验探讨机动车尾气对HepG2细胞的体外遗传毒性，为进一步在机动车尾气暴露人群开展遗传生物监测提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 机动车尾气有机提取物准备 选某公交客车(燃烧汽油)于怠速状态下，用中流量空气采样器收集汽车尾气颗粒物，流量为10 L/min，颗粒物经玻璃纤维滤膜阻留，采样30 min。滤膜经干燥、恒重后保存。取采集了机动车尾气颗粒物的玻璃纤维滤膜，切除相当于30 mg颗粒物的滤膜，剪成小块，置于具塞三角烧杯中，分数次加入150 mL二氯甲烷(CH2Cl2)，用250 mA的超声波提取3次，40 min/次。过滤提取液，合并于蒸发皿中，45℃水浴挥发至干，用二甲基亚砜(DMSO)溶解成含颗粒物30 g/L的提取物，低温保存备用。

1.2 细胞株 人肝癌HepG2细胞(购于协和医科大学基础研究所细胞中心)贴壁生长于含体积分数10%小牛血清的DMEM培养基中，在体积分数5%CO2培养箱中37℃下常规传代培养。

1.3 汽车尾气有机提取物细胞毒性测定［6］HepG2细胞接种于96孔板，密度为1×105mL－1，每孔100 μL;培养24 h后，加入不同质量浓度有机提取物(2.5、5.0、10.0、20.0、40.0 和 80.0 mg/L)，作用24 h，每组设6个平行孔。溶剂对照组加体积分数0.1%DMSO，空白组只加培养液、MTT和DMSO。用MTT法测定各组HepG2细胞存活率。染毒结束后，轻轻吸弃上清液，每孔加入100 L MTT(0.5 g/L)，继续培养4 h后，轻轻吸弃上清液，每孔加入150 L DMSO，于摇床上低速摇荡10 min，使紫色结晶完全溶解，用酶标仪以490 nm波长测定吸光度(A)值，计算细胞存活率。细胞存活率=(实验组A值－空白组A值)/(对照组A值－空白组A值)。

1.4 CBMN试验［7］细胞传代后，接种至6孔板，密度为5×104mL－1，每孔2 mL。培养24 h后，吸弃上清液。每孔加入2 mL不同质量浓度有机提取物(2.5、5.0 和 10.0 mg/L)，每组各设 6 个平行孔。同时设溶剂对照组(体积分数0.1%DMSO)及阳性对照组(博莱霉素，2 mg/L)。24 h后弃去培养液，PBS洗涤3次，加入新鲜的含体积分数10%胎牛血清的完全培养基，同时加入细胞松弛素B，终浓度为3 mg/L，继续培养1.5个细胞周期。作用结束后，胰蛋白酶消化后离心收集细胞。0.075 mol/L KCl低渗，体积比3∶1的甲醇、冰醋酸固定后滴片。将玻片置于室温下自然干燥过夜。使用体积分数10%Gimsa染液染色10 min，于1 000倍镜下计数1 000个双核细胞中的微核数。每组分析6张片子。

1.5 彗星试验［8-9］细胞传代后，接种至6孔板，密度为5×104mL－1，每孔2 mL。培养24 h后，吸弃上清液。每孔加入2 mL不同质量浓度有机提取物(2.5、5.0 和 10.0 mg/L)，每组设 6 个平行孔。同时设溶剂对照组及阳性对照组(同1.4)。染毒24 h后弃去培养液，PBS洗涤3次，胰蛋白酶消化后离心收集细胞。常规制片、裂解、解旋、电泳、中和及脱水、染色和分析，使用国产彗星试验图像分析软件IMI 1.0分析照片，每孔测量50个细胞［9］。以Olive尾矩作为DNA损伤指标进行分析。

1.6 统计学处理 采用SPSS 13.0进行分析，应用单因素方差分析和SNK-q检验比较各组间微核率和Olive尾矩的差异，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 机动车尾气有机提取物对HepG2细胞毒性作用 结果见图1。可以看出，在低剂量范围内(2.5、5.0和10.0 mg/L)，有机提取物对HepG2未表现出细胞毒性，但随着剂量的升高，细胞存活率降低。在后续的CBMN试验和彗星试验中机动车尾气有机提取物的最高作用质量浓度选择10.0 mg/L。

图1 不同质量浓度的机动车尾气有机提取物对HepG2细胞存活率的影响

2.2 机动车尾气有机提取物对HepG2细胞微核率和Olive尾矩的影响 结果见表1。

表1 机动车尾气有机提取物对HepG2细胞双核细胞微核率及Olive尾矩的影响

3 讨论

微核是指细胞经历了一个有丝分裂周期后遗留在胞质中的染色体断片或整条染色体。1985年Fe-nech在传统微核方法的基础上首先建立了CBMN试验方法。与传统细胞微核试验方法比较，CBMN仅计数分裂一次细胞的微核数，解决了由于个体间细胞动力学不同所致的结果差异，提高了方法的准确性［10］。而且人类微核计划实施后，制定了标准化的实验方法，并阐明了年龄、性别等因素对一般人群基线微核率的影响。该方法成熟简便，涂片保存容易，且可被多人重复分析。因此CBMN试验方法被广泛应用于环境化学污染物质遗传毒性筛检。

该研究结果显示机动车尾气有机提取物对HepG2细胞具有明显的遗传毒性作用，5.0和10.0 mg/L有机提取物组微核率高于溶剂对照组。机动车尾气中含有大量的致突变/致癌物如多环芳烃及其类似物，苯并(a)芘是其中重要的一种，能引起微核率升高，该实验中有机提取物引起的HepG2细胞微核率升高可能因为机动车尾气中含有大量的苯并(a)芘，但这种推测尚需对所采集的机动车尾气的组成成分进一步分析加以验证。

彗星试验是检测单个细胞DNA链断裂应用最广泛的技术，其指标可以作为DNA损伤的生物标志。Olive尾矩则是综合反映细胞DNA损伤程度的一个指标，既与彗星长度呈正相关，又与细胞尾部DNA百分比呈正相关。该研究结果表明，机动车尾气有机提取物各剂量组细胞Olive尾矩明显高于溶剂对照组。说明机动车尾气有机提取物能够引起体外培养的HepG2细胞DNA链发生断裂。Zhang等［11］研究发现，汽油汽车尾气可诱导 A549细胞DNA损伤，在彗星试验中细胞拖尾率及DNA迁移长度均随尾气浓度的增加而增加。Xu等［12］报道与阴性对照组比较，机动车尾气微颗粒物可引起A549细胞拖尾率及尾长度明显增加。该研究结果和上述报道一致，在不同组织来源的细胞系中得到了相似的结果。

作者还发现，2.5 mg/L机动车尾气有机提取物可引起HepG2细胞Olive尾矩明显升高，并使微核率明显升高，提示彗星试验在检测机动车尾气引起的遗传损伤时可能比CBMN试验敏感。推测可能由于彗星试验是在去除处理因素后收集细胞进行试验，此时细胞还没有足够时间进行DNA损伤修复，检出的是初级的未经修复的DNA损伤，而CBMN试验检出的是细胞经历一个细胞周期后固定下来的突变，在此过程中细胞可能启动了修复机制，对低剂量引起的DNA损伤进行了部分修复，所以在经历一个细胞周期后，轻微的损伤完全修复后不再形成微核［13-14］。

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