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植物血凝素对仔猪免疫功能的影响试验

2011-06-19陈元坤吴学渊杨海涵

四川畜牧兽医 2011年9期
关键词:血凝素猪瘟淋巴细胞

李 超,陈元坤,吴学渊,杨海涵

(四川省新兽药工程技术研究中心,四川 成都 611130)

植物血凝素(PHA)是一种从豆科植物中提取的有丝分裂原,作为一种低聚糖与蛋白质的复合物,植物血凝素有促进淋巴细胞有丝分裂、激活免疫细胞的作用。本试验研究了植物血凝素对仔猪免疫功能方面的影响,以进一步证实其免疫增强功能。

1 试验材料

1.1 试验动物 品种相同、体重相近的未进行猪瘟疫苗免疫的35日龄仔猪60头,由成都乾坤动物药业有限公司实验猪场提供。

1.2 试验药品及试剂 猪瘟兔化弱毒疫苗(批号110205,大北农公司),猪瘟病毒IgG抗体检测试剂盒(批号2011.4.01,深圳绿诗源生物技术有限公司),动物淋巴细胞分离液SC1083(批号2011.1.12,北京五洲元业科贸公司);α-醋酸萘酯、甲基绿、品红、亚硝酸钠(北京索莱宝科技有限公司);鸡子豆购自超市。

1.3 试验仪器 JJ-2型高速组织捣碎匀浆机,XFB-200小型高速粉碎机,IMark 10608型酶标仪,显微镜,离心机等。

2 试验方法

2.1 植物血凝素(PHA)的制备 称取鸡子豆适量,粉碎,加入适量蒸馏水4℃冰箱放置,吸胀24 h,在高速组织捣碎匀浆机内12000 r/min匀浆2次,每次5min,置4℃冰箱抽提24h。再用纱布过滤,滤渣弃掉,滤液以4800 r/min离心20min,收集上清液,进行活性测定。

活性测定采用红细胞凝集实验。通过翅静脉采集新鲜公鸡血,用3.8%枸橼酸钠抗凝,3 000 r/min离心15min,去上清,收集沉淀的红细胞,再用生理盐水洗涤3次,最后用生理盐水配成1%~2%红细胞悬液。将PHA倍比稀释成21~210等梯度,结果以使红细胞凝集50%以上的PHA的最大稀释倍数为血凝效价。测定血凝效价后加入适量甘露醇、蔗糖进行真空冷冻,干燥,然后称重,计算PHA冻干粉的重量。

2.2 猪瘟疫苗免疫 将60头仔猪随机分为4组,每组15头,Ⅰ组为空白不注射药物对照组,Ⅱ组为PHA低剂量组,Ⅲ组为中剂量组,Ⅳ组为高剂量组。试验Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组每头注射猪瘟疫苗2头份,再分别注射PHA 冻干粉 7、14、70mg/kg,连续注射 PHA 3 d,每天1次;试验Ⅰ组(对照组)每头注射猪瘟疫苗2头份后,再注射等体积生理盐水为对照。免疫接种和注射药物后,几个组进行相同的饲养管理。

2.3 血样收集及猪瘟抗体测定 猪瘟疫苗免疫前1 d和免疫后15 d通过前腔静脉采血7~8mL,取4mL血液用枸橼酸钠抗凝,用于血液淋巴细胞计数;其余的析出血清供猪瘟抗体测定用。抗体测定方法参照试剂盒说明,结果判定标准为:OD值<0.2为抗体阴性,0.2<OD值<0.4为可疑,OD值>0.4为抗体阳性。试验数据用SPSS11.5统计学软件进行T检验,以“平均数±标准差”表示。

2.4 淋巴细胞计数

2.4.1 淋巴细胞分离 用等体积生理盐水稀释上述抗凝血液,取3mL淋巴细胞分离液加入离心管管底,并升温到室温,用加样器吸取6mL稀释后的血液样品,沿管壁缓慢铺到淋巴细胞分离液上面,勿打乱液层界面,室温下2 000 r/min离心20min。离心后管底是红细胞,中间层是分离液,最上层是血浆。血浆层与分离液之间是一薄层较致密的白膜,含单个核细胞(包括淋巴细胞和单核粒细胞),用吸管直接插入到单个核细胞层并吸取该层,放入另一试管中,再加入10mL生理盐水稀释,1 000 r/min离心 10min,弃上清。重复洗涤1~2次,除去血小板和抗凝物质,最后用生理盐水稀释备用。

2.4.2 染色计数 应用酸性α醋酸萘酯酶(ANAE)染色法进行染色计数。方法:将淋巴细胞涂片,自然干燥后用2.5%戊二醛4℃下固定10min,然后用蒸馏水冲洗,自然干燥。于固定的标本片上滴加染色液,以覆盖为度,37℃染色45~60min,蒸馏水冲洗。再用甲基氯复染1~5min,蒸馏水冲洗,自然干燥,镜检。在胞浆内出现大小不一、数量不等的黑红色颗粒细胞即为T淋巴细胞,无此颗粒的为B淋巴细胞。同时计数淋巴细胞100~200个,求出它们各占的百分比。试验数据用SPSS11.5统计学软件进行T检验,以“平均数±标准差”表示。

3 试验结果

3.1 PHA的制备 提取的PHA经血凝活性测定效价为28,冻干后每瓶PHA重87mg。

3.2 猪瘟抗体测定结果 猪瘟抗体测定结果如表1所示。从表1可以看出,猪瘟疫苗免疫前各组的抗体水平均趋于阴性,抗体水平差异不显著(P>0.05);免疫后15d,抗体均转为阳性,抗体平均水平最高的为高剂量组,其次为中、低剂量组和对照组,其中高剂量组与对照组相比差异极显著(P<0.01),中、低剂量组和对照组相比,差异显著(P<0.05),而低、中、高剂量各组之间的差异不显著(P>0.05)。说明不同剂量的植物血凝素均可显著增强猪瘟疫苗的免疫应答,提高其抗体水平,并存在量效依赖关系。

3.3 淋巴细胞计数结果 淋巴细胞计数结果如表2所示。几个组在猪瘟疫苗免疫前(未注射PHA前),其T淋巴细胞百分率差异不显著(P>0.05);在免疫后(注射PHA后)15 d,低、中、高剂量组和对照组相比,其T淋巴细胞百分率均显著提高(P<0.05),以高剂量组的T淋巴细胞百分率最高,而低、中、高剂量组之间无统计学差异(P>0.05)。说明植物血凝素能显著提高T淋巴细胞的百分率,有促进T细胞分化增殖的作用,且与PHA用药剂量呈正相关。

4 讨论

植物血凝素主要用于激活免疫细胞——淋巴细胞,是一种干扰素诱导剂,不仅可以刺激机体产生白介素-2和干扰素,还可以刺激机体产生非特异性抗体。植物血凝素与黄芪多糖等多种中草药联用具有增效作用,与部分抗生素联用具有相加作用。因其强大的增强机体非特异性免疫力的作用以及抗病毒作用,植物血凝素在兽药中的应用已日益广泛。本研究表明,植物血凝素能显著增强猪瘟疫苗免疫后的抗体水平,显著提高T淋巴细胞的百分率,并存在量效依赖关系。

表1 猪瘟疫苗免疫前后抗体OD值

表2 淋巴细胞计数结果

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