植物血凝素对仔猪免疫功能的影响试验

2011-06-19陈元坤吴学渊杨海涵

四川畜牧兽医 2011年9期

关键词：血凝素猪瘟淋巴细胞

李超，陈元坤，吴学渊，杨海涵

（四川省新兽药工程技术研究中心，四川成都 611130）

植物血凝素（PHA）是一种从豆科植物中提取的有丝分裂原，作为一种低聚糖与蛋白质的复合物，植物血凝素有促进淋巴细胞有丝分裂、激活免疫细胞的作用。本试验研究了植物血凝素对仔猪免疫功能方面的影响，以进一步证实其免疫增强功能。

1 试验材料

1.1 试验动物品种相同、体重相近的未进行猪瘟疫苗免疫的35日龄仔猪60头，由成都乾坤动物药业有限公司实验猪场提供。

1.2 试验药品及试剂猪瘟兔化弱毒疫苗（批号110205，大北农公司），猪瘟病毒IgG抗体检测试剂盒（批号2011.4.01，深圳绿诗源生物技术有限公司），动物淋巴细胞分离液SC1083（批号2011.1.12，北京五洲元业科贸公司）；α-醋酸萘酯、甲基绿、品红、亚硝酸钠（北京索莱宝科技有限公司）；鸡子豆购自超市。

1.3 试验仪器 JJ-2型高速组织捣碎匀浆机，XFB-200小型高速粉碎机，IMark 10608型酶标仪，显微镜，离心机等。

2 试验方法

2.1 植物血凝素（PHA）的制备称取鸡子豆适量，粉碎，加入适量蒸馏水4℃冰箱放置，吸胀24 h，在高速组织捣碎匀浆机内12000 r/min匀浆2次，每次5min，置4℃冰箱抽提24h。再用纱布过滤，滤渣弃掉，滤液以4800 r/min离心20min，收集上清液，进行活性测定。

活性测定采用红细胞凝集实验。通过翅静脉采集新鲜公鸡血，用3.8%枸橼酸钠抗凝，3 000 r/min离心15min，去上清，收集沉淀的红细胞，再用生理盐水洗涤3次，最后用生理盐水配成1%～2%红细胞悬液。将PHA倍比稀释成21～210等梯度，结果以使红细胞凝集50%以上的PHA的最大稀释倍数为血凝效价。测定血凝效价后加入适量甘露醇、蔗糖进行真空冷冻，干燥，然后称重，计算PHA冻干粉的重量。

2.2 猪瘟疫苗免疫将60头仔猪随机分为4组，每组15头，Ⅰ组为空白不注射药物对照组，Ⅱ组为PHA低剂量组，Ⅲ组为中剂量组，Ⅳ组为高剂量组。试验Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组每头注射猪瘟疫苗2头份，再分别注射PHA 冻干粉 7、14、70mg/kg，连续注射 PHA 3 d，每天1次；试验Ⅰ组（对照组）每头注射猪瘟疫苗2头份后，再注射等体积生理盐水为对照。免疫接种和注射药物后，几个组进行相同的饲养管理。

2.3 血样收集及猪瘟抗体测定猪瘟疫苗免疫前1 d和免疫后15 d通过前腔静脉采血7～8mL，取4mL血液用枸橼酸钠抗凝，用于血液淋巴细胞计数；其余的析出血清供猪瘟抗体测定用。抗体测定方法参照试剂盒说明，结果判定标准为：OD值＜0.2为抗体阴性，0.2＜OD值＜0.4为可疑，OD值＞0.4为抗体阳性。试验数据用SPSS11.5统计学软件进行T检验，以“平均数±标准差”表示。

2.4 淋巴细胞计数

2.4.1 淋巴细胞分离用等体积生理盐水稀释上述抗凝血液，取3mL淋巴细胞分离液加入离心管管底，并升温到室温，用加样器吸取6mL稀释后的血液样品，沿管壁缓慢铺到淋巴细胞分离液上面，勿打乱液层界面，室温下2 000 r/min离心20min。离心后管底是红细胞，中间层是分离液，最上层是血浆。血浆层与分离液之间是一薄层较致密的白膜，含单个核细胞（包括淋巴细胞和单核粒细胞），用吸管直接插入到单个核细胞层并吸取该层，放入另一试管中，再加入10mL生理盐水稀释，1 000 r/min离心 10min，弃上清。重复洗涤1～2次，除去血小板和抗凝物质，最后用生理盐水稀释备用。

2.4.2 染色计数应用酸性α醋酸萘酯酶（ANAE）染色法进行染色计数。方法：将淋巴细胞涂片，自然干燥后用2.5%戊二醛4℃下固定10min，然后用蒸馏水冲洗，自然干燥。于固定的标本片上滴加染色液，以覆盖为度，37℃染色45～60min，蒸馏水冲洗。再用甲基氯复染1～5min，蒸馏水冲洗，自然干燥，镜检。在胞浆内出现大小不一、数量不等的黑红色颗粒细胞即为T淋巴细胞，无此颗粒的为B淋巴细胞。同时计数淋巴细胞100～200个，求出它们各占的百分比。试验数据用SPSS11.5统计学软件进行T检验，以“平均数±标准差”表示。

3 试验结果

3.1 PHA的制备提取的PHA经血凝活性测定效价为28，冻干后每瓶PHA重87mg。

3.2 猪瘟抗体测定结果猪瘟抗体测定结果如表1所示。从表1可以看出，猪瘟疫苗免疫前各组的抗体水平均趋于阴性，抗体水平差异不显著（P＞0.05）；免疫后15d，抗体均转为阳性，抗体平均水平最高的为高剂量组，其次为中、低剂量组和对照组，其中高剂量组与对照组相比差异极显著（P＜0.01），中、低剂量组和对照组相比，差异显著（P＜0.05），而低、中、高剂量各组之间的差异不显著（P＞0.05）。说明不同剂量的植物血凝素均可显著增强猪瘟疫苗的免疫应答，提高其抗体水平，并存在量效依赖关系。

3.3 淋巴细胞计数结果淋巴细胞计数结果如表2所示。几个组在猪瘟疫苗免疫前（未注射PHA前），其T淋巴细胞百分率差异不显著（P＞0.05）；在免疫后（注射PHA后）15 d，低、中、高剂量组和对照组相比，其T淋巴细胞百分率均显著提高（P＜0.05），以高剂量组的T淋巴细胞百分率最高，而低、中、高剂量组之间无统计学差异（P＞0.05）。说明植物血凝素能显著提高T淋巴细胞的百分率，有促进T细胞分化增殖的作用，且与PHA用药剂量呈正相关。

4 讨论

植物血凝素主要用于激活免疫细胞——淋巴细胞，是一种干扰素诱导剂，不仅可以刺激机体产生白介素-2和干扰素，还可以刺激机体产生非特异性抗体。植物血凝素与黄芪多糖等多种中草药联用具有增效作用，与部分抗生素联用具有相加作用。因其强大的增强机体非特异性免疫力的作用以及抗病毒作用，植物血凝素在兽药中的应用已日益广泛。本研究表明，植物血凝素能显著增强猪瘟疫苗免疫后的抗体水平，显著提高T淋巴细胞的百分率，并存在量效依赖关系。