MMP-2和TIMP-2 mRNA在大鼠颈动脉粥样硬化中的动态表达*

王庆林， 郭向东， 邵 坤， 贾 娟， 万光瑞

(1.河南职工医学院儿科教研室，郑州451191;2.河南中医学院第一附属医院耳鼻喉科，郑州450000;3.新乡医学院 生理教研室，河南 新乡453003)

细胞外基质合成减少和降解增加是颈动脉粥样硬化(artery atherosclerosis，AS)斑块不稳定主要原因，而基质金属蛋白酶-2(matrix metalloproteinase-2，MMP-2)是细胞外基质降解的重要因素［1］。本实验通过血管钳夹术和高脂饮食 (钳-脂法)建立大鼠颈AS模型［2］，并检测MMP-2和基质金属蛋白酶组织抑制剂-2(tissue inhibitor of metalloproteinase-2，TIMP-2)表达的动态变化，旨在观察斑块生长过程中斑块稳定性的变化。

1 材料与方法

1.1 动物和试剂 健康雄性SD大鼠40只，体重(200±10)g，由新乡医学院实验动物中心提供。主要试剂有 PrimeScriptTMRT-PCR Kit试剂盒、Trizol(大连宝生物工程公司)、PCR引物(由上海生物工程合成)。

1.2 实验动物分组 动物随机分为2组，正常对照组(n=10)，喂基础饲料;钳-脂组(n=30)，先实施颈总动脉钳夹术，术后高脂饲料喂养(含10%蛋黄、8%猪油、0.2% 丙基硫氧嘧啶、0.5% 胆盐、4.8% 食盐)，根据喂养的时间分为3个亚组:喂养2周组(n=10)、喂养6周组(n=10)和喂养10周组(n=10)。所有动物均单笼喂饲，饮水不限，每日每只进食25 g饲料。

1.3 动物模型制备 参考王庆林等的实验方法建立大鼠颈AS模型［2］。实验动物术前12 h禁食，不禁水，腹腔注射水合氯醛(0.3 ml/100 g)麻醉，去毛备皮(颈部下正中)，仰卧固定于手术台上。消毒颈部皮肤，沿颈部正中切开皮肤5.0 cm左右，于甲状软骨平面向下分离左侧颈总动脉3.0 cm，使用自制血管钳钳夹一侧颈总动脉，钳夹长度为1.5 cm，强度一扣，时间20 min，缝合皮肤。术后连续3 d每日肌注青霉素80万单位。

1.4 RT-PCR半定量法测定颈总动脉组织中MMP-2、TIMP-2 mRNA表达 实验动物于各时间点处死，取左侧颈总动脉，剥离血管外周结缔组织，加入1 ml Trizol，提取组织中 RNA。分光光度法(A260/A280)检测RNA纯度与含量，置于-70℃保存。

从Gene Bank上下载鼠MMP-2和TIMP-2 mRNA序列全长，利用引物设计软件Primer Premier 5.0设计引物如下:MMP-2(长度434 bp):上游5＇-ATGGAGGCACGATTGGTCTG-3＇，下游 5＇-GCAAAGGCATCATCCACTGTC-3＇;TIMP-2(长度 519 bp):上游 5＇-AAAGCAGTGAGCGAGAAGGAG-3＇，下游 5＇-CGGGTCCTCGATGTCAAGAAA-3＇;对照引物 β-actin(长度 242 bp):上游:5＇-ATGGATGACGATATCGCTGCG-3＇，下 游:5＇-TCGTCCCAGTTGGTGACAATG-3＇。PCR扩增条件为:94℃预变性2 min，94℃变性45 s，55℃退火1min，72℃延伸1 min，30个循环，最后72℃延伸5 min。用1.8%的琼脂糖凝胶电泳，以Bander leader 3.0凝胶图像处理软件进行灰度分析，以同一样品的β-actin信号值作校正，以对照组的灰度值为1，实验组数据与对照组相比取值。1.5统计学处理数据以均数±标准差(±s)表示，应用SPSS 13.0统计软件进行分析，多组之间显著性检验用方差分析，两两均数比较采用LSD检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

RNA样品的A260/A280值均大于1.8，提示样品的纯度较高，RNA无降解，并无明显蛋白质的污染。PCR产物琼脂糖凝胶电泳结果显示，钳-脂各组的MMP-2和TIMP-2 mRNA逐渐增高，与正常对照组相比差异有统计学意义(P＜0.05)。MMP-2/TIMP-2 mRNA水平:正常对照组＜钳-脂2周组＜钳-脂10周组，钳-脂6周组较其他三组低，见表1、图1～2。

表1 大鼠颈总动脉组织MMP-2和TIMP-2 mRNA的表达(±s)

表1 大鼠颈总动脉组织MMP-2和TIMP-2 mRNA的表达(±s)

注:与正常组比较，1)P＜0.05;与钳-脂2周比较，2)P＜0.05;与钳 -脂6 周比较，3)P ＜0.05。

TIMP-2 mRNA正常对照组组别 MMP-2 mRNA TIMP-2 mRNA MMP-2/1 1 1钳 -脂2周 1.88±0.131) 1.69 ±0.101)1.12 ±0.111)钳 -脂6 周 2.64 ± O.171，2)2.99 ±0.121，2)0.88 ±0.071)钳 - 脂 10 周 4.15 ±0.381，2，3)3.13 ± 0.231，2，3)1.32 ±0.141)

图1 各组大鼠颈总动脉组织MMP-2 mRNA的表达变化

3 讨论

MMPs与TIMPs的平衡共同调节细胞外基质的降解与合成，成为动脉粥样硬化斑块研究的热点，而MMP-2和其内源性特异性抑制因子TIMP-2是关键酶。本实验结果发现:随着 AS的进展，MMP-2 mRNA的表达程度逐渐增强，与已有的研究相一致［3］。有关TIMP的实验不多且结论不一致。有实验显示，动脉粥样硬化TIMP-2的表达减弱［4］;另一组实验显示，大鼠去内膜损伤模型的TIMP-2较正常对照组明显增高［5］。本实验RT-PCR结果显示:随着AS的进展，TIMP-2 mRNA的表达逐渐增强。Woessner JF［6］的研究表明:TIMP-2多随MMP-2表达而表达;Turu MM等的研究表明:在MMP-2高表达的同时，TIMP-2表达也有所增加，只是部分抵消了MMP-2增加的活性［7］，这些与本实验的结论相一致。TIMPs的高表达可能与机体在各种刺激下，对增生内膜表达MMPs增加的一种代偿性反应有关。

图2 各组大鼠颈总动脉组织TIMP-2 mRNA的表达变化

有关MMPs和TIMPs的大部分研究割裂两者之间的关系，或仅从AS的某一阶段进行研究，未能将MMPs和TIMPs结合起来，从AS的整个过程进行动态研究，结论具有片面性。因此本实验又将RTPCR法半定量数值进行MMP-2/TIMP-2 mRNA处理比较，旨在研究这一对相互抑制的物质，究竟哪一个占主导。该研究发现:MMP-2/TIMP-2 mRNA水平依次为正常对照组＜钳-脂2周组＜钳-脂10周组，钳-脂6周组较其他三组低。笔者推测MMP-2/TIMP-2 mRNA比例失衡导致AS的机制可能是:在早期，由于多种致AS因素的作用，导致受累血管MMP-2的表达升高，虽特异性抑制物TIMP-2也升高，但不及 MMP-2，导致 MMP-2/TIMP-2比例失衡。虽然基质降解、合成代谢均增强，但降解强于合成，利于中层平滑肌细胞向内膜下的迁移和增殖，造成内膜增厚;在中期，TIMP-2增高的程度超过MMP-2，Jo Y等发现:TIMP-2只有在较高浓度时才会对MMP-2有抑制作用［8］，故推测在 6周时可能是TIMP-2达到了较高浓度，抑制明胶酶活性，基质合成强于降解，促进纤维增生，形成纤维增生斑块;到后期，随着 AS的进展，MMP-2增高程度又强于TIMP-2，降解强于合成，促进纤维斑块的降解，致使斑块破裂。

斑块的稳定性是个多因素参与的复杂过程，通过MMPs/TIMPs系统的活性调节延缓动脉粥样硬化的发生、防止斑块破裂，具有重要的临床意义。本实验仅从MMP-2和TIMP-2两个方面进行判断，存在一定的局限性，尚待结合其他分子生物学手段深入研究。

［1］Vigetti，Rizzi M，Viola M，et al.The effects of 4-methylumbelliferone on hyaluronan synthesis，MMP-2 activity，proliferation and motility of human aortic smooth muscle cells［J］.Glycobiology，2009，19(5):537-546.

［2］王庆林，陈文捷，万 佳，等.颈总动脉钳夹术加高脂饮食建立大鼠颈动脉粥样硬化模型［J］.实用医学杂志，2010，26(4):562-564.

［3］Fiotti N，Xiong W，Giansante C.MMP-2 genetic variant and plaque features of instability［J］.Atherosclerosis，2010，210(1):43-44.

［4］Matsumoto T，Watanabe H，Ueno T，et a1.Appropriate doses of granulocyte colony stimulating factor reduced atherosclerotic plaque formation and increased plaque stability in cholesterol-fed rabbits［J］.J Atheroscler Thromb，2010，17(1):84-96.

［5］Dollery CM，Libby P.Atherosclerosis and proteinase activation［J］.Cardiovasc Res，2006，69:625-635.

［6］Woessner JF.Matrix metalloproteinase inhibition，From the Jurassic to the third millennium［J］.Ann N Y Acad Sci，2008，878:388-403.

［7］Turu MM，Krupinski J，Catena E，et a1.Intraplaque MMP-8 levels are increased in asymptomatic patients with carotid plaque progression on ultrasound［J］.Atberoscl Erosis，2006，187(1):161-169.

［8］Jo Y，Kim HJ.Analysis of tissue inhibitor of metalloproteinase-2 effet on promatrix metalloproteinas-2 activation by membrane type 1 Matrix Metalloproteinas using baculovirus insect expressionsystem［J］.Biochem J，2008，345:511-519.