M TT法和WST-8法检测三羟异黄酮对SW480细胞生长抑制的比较*

何 浪,李国军,刘光波,王 丹△

(1.成都医学院生物医学系 610081;2.成都医学院临床医学本科2007级 610081;3.辽宁建筑职业技术学院,辽宁辽阳111000)

在细胞毒性实验中,M TT比色法自1983年建立以来[1],已成为细胞生物学及相关研究领域的一种分析细胞活性、生长增殖和抗癌药物筛选及临床肿瘤药敏试验的常用方法[2]。但该法需加入二甲基亚砜(DMSO)溶解甲臜颗粒,可能遇到颗粒不完全溶解以及在吸取上清液的操作中易带走部分细胞等问题。利用 Cell counting kit-8(CCK-8)检测细胞活性的方法(WST-8法)[3]。只需将CCK-8试剂按比例加入到细胞培养板中,经过一定时间孵育,活细胞即可将WST-8代谢为水溶性的甲臜染料,即可直接测定细胞活性[4]。现将MT T、WST-8法检测三羟异黄酮(genistein,GEN)对SW480细胞的生长抑制比较报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料 结肠癌细胞SW480(成都医学院生物技术实验室保存)。RPMI1640培养基、胎牛血清、M TT,GEN。活细胞计数试剂盒CCK-8、WST-8试剂(碧云天生物技术研究所)。

1.2 试剂 GEN用DMSO溶解,实验时用RPM I1640培养液稀释,终浓度分别为25、50、100、200 mol/L[5],DMSO 终浓度小于0.1%。

1.3 细胞培养 选用对数生长期、台盼蓝拒染率大于95%的SW480细胞,用含10%胎牛血清的RPM I1640培养液培养,含青霉素100 U/mL、链霉素100 g/mL,置 37 ℃、5%CO2温箱中,2～3 d换液1次,当细胞丰度超过 80%时传代。

1.4 M TT、WST-8法检测GEN对SW480细胞生长的抑制作用 将处于对数生长期的SW480细胞用0.25%胰蛋白酶消化,6×103/孔接种于96孔板中。空白对照加入含DMSO的RPMI1640培养液,置于37℃、5%CO2。细胞贴壁,进入指数生长期后,加入不同浓度 GEN 培养液(0、25、50、100、200 mol/L)200μL,每个浓度设8个平行孔。继续培养48 h后分别用MTT、WST-8法测定各孔的光密度(optical density,OD)值(分别为A570、A450,以空白对照调零)。具体操作按试剂说明书进行。以下公式计算出GEN对SW480细胞生长抑制率:

细胞生长抑制率=(1-药物组OD值/细胞对照组OD值)×100%。

1.5 WST-8法孵育时间 细胞接种同上,给药48 h后加20 μ L CCK-8溶液,细胞培养箱内继续孵育 0.5、1、2、4 h,分别测定各孔的OD值(A450,以空白对照调零)。

1.6 统计学处理 应用SPSS11.0统计软件进行数据分析。组间OD值比较采用单因素方差分析,两两比较采用LSD法。生长抑制率的比较采用配对计量资料的符号秩和检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

两种测定方法均表明,GEN作用48 h后SW480细胞的生长明显受抑制,并且随着GEN浓度的增加,这种抑制作用亦增强。这两种测定方法所得GEN在25～200 mol/L各浓度时对SW480细胞的生长抑制率比较,差异无统计学意义(P＞0.05)。见表1。不同浓度GEN作用后的加入CCK-8试剂后孵育不同时间,随孵育时间增加,OD值逐渐增加至4 h时已足够用于测量,但在孵育1～2 h之间,OD值增幅较小,GEN浓度分别为 25、50、100、200 mol/L 时,趋势相同,故认为对于SW480细胞,WST-8法测量 OD值的最佳时间为孵育1～2 h。1～2 h中,WST-8法OD值高于MT T法,短时间内反映细胞增殖抑制状况优于M TT法,见表2。

表1 两种方法测定GEN作用后抑制率比较

表2 两种方法不同作用时间后OD值比较(±s)

表2 两种方法不同作用时间后OD值比较(±s)

加MT T或CCK-8后继续孵育时间 MT T法 WST-8法1 h 0.257±0.046 0.430±0.035 2 h 0.380±0.016 0.477±0.055

3 讨 论

GEN是大豆中主要的异黄酮成分,已经被发现可以抑制多种肿瘤细胞的生长,成为一种很有潜力的生物抗肿瘤药物,但其具体机制尚未完全清楚[6-9]。本研究表明,GEN能对结肠癌SW480细胞增殖产生明显的抑制作用,这种作用存在浓度依赖性。但是用两种方法测定的细胞生长抑制率无统计学差异,故认为两种方法均能准确反映细胞的增殖抑制状况。

CCK-8试剂中含有WST-8,其化学名称为2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四唑单钠盐。WST-8在电子载体1-Methoxy PMS的作用下能被细胞线粒体中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的橙黄色甲臜物,生成的甲臜数量与活细胞的数量成正比,通过酶标仪测量细胞液的A450,可检测出待测细胞样品的活性[3]。同时,反应所生成甲臜晶体数量与加入检测试剂后继续培养的时间之间具有较大的相关性,且对不同种类的细胞在恰当的检测时机方面均存在细微的差别。本研究结果显示,WST-8法短时间内反映细胞增殖抑制状况优于M TT法。

综上所述,M TT、WST-8法用于细胞活性计数最终结果相似,而WST-8法与M TT法相比操作相对简便,短时间内测定反映细胞增殖状况优于M TT法,应用价值较大。WST-8法结果不仅客观准确,且大大减轻工作量和时间,具有一定的实用性和经济性。

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