bFGF在大鼠心肌纤维化中的表达

姜铁超,邹颖刚,于晓艳,杨 萍*

(1.吉林大学中日联谊医院,吉林长春130033;2.吉林大学第二医院;3.吉林大学药学院)

心肌纤维化(myocardial fibriosis,MF)是指在心肌细胞外基质中胶原含量显著升高。这种病理变化在多种心血管疾病中存在,是多种心脏疾病发展到一定阶段的共同病理改变,是心肌重构的主要表现之一[1-5]。成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factors,FGF),又称为肝素结合因子,是一组蛋白质结构相关的多基因大家族。到目前为止,发现FGF超家族共有23个成员,分别命名为FGF1-23。本实验旨在探讨bFGF在大鼠MF中的表达。

1 材料与方法

1.1试剂与仪器盐酸异丙肾上腺素注射液(Iso),由上海禾丰制药有限公司生产;羊抗大鼠FGF单克隆抗体,由博士德公司提供;SP-9000免疫细胞化学试剂盒,由北京中杉金桥生物技术有限公司提供;莱卡4215切片机(德国);OlympusPM-10AO全自动显微照相装置(日本)。

1.2实验动物及分组雄性Wistar大鼠20只,体重180-220 g,由吉林大学实验动物中心提供。分为正常对照组及Iso组(包括12 h,72 h及1周组),每组5只。

1.3HE组织化学染色取材经10%福尔马林固定30 min,常规石蜡包埋。用二甲苯脱腊10 min,用100%乙醇置换二甲苯2 min、95%乙醇置换1 min、80%乙醇置换1 min及用75%乙醇置换1 min,蒸馏水冲洗2 min。苏木素染色5 min,自来水冲洗。盐酸乙醇分化30 s。自来水浸泡15 min。伊红染 2 min。常规脱水,透明,中性树胶封闭剂封片。

1.4bFGF蛋白组织化学染色石蜡切片,常规脱蜡至水。蒸馏水冲洗,PBS浸泡5 min。3%H2O2去离子水(无色液体)孵育5-10 min,以消除内源性过氧化物酶活性。滴加试剂A(蓝色液体)室温孵育10-15 min,倾去,勿洗。滴加适当比例稀释的一抗,4℃过夜。PBS冲洗,3 min×3次。滴加试剂B(黄色液体),室温或37℃孵育10-15 min。PBS冲洗,3 min×3次。滴加试剂C(橙色液体),室温孵育10-15 min。PBS冲洗,3 min×3次。DAB显色。自来水充分冲洗。复染,脱水,透明。中性树胶封闭剂封片。

1.5统计学方法实验数据以s表示,采用SPSS 11.0统计软件进行方差分析。

2 结果

2.1HE与bFGF免疫组织化学染色结果正常对照组心肌排列整齐,横纹清晰,胞核明显,无细胞肿胀。注射Iso 12 h后,心肌出现较多点状坏死。注射Iso 1周后,出现界限清晰、多发散在坏死灶,坏死灶内有旺盛的成纤维细胞增生,并可见一定量的胶原纤维。图1。

Fig.1 The observation results of HE under light microscope(×400).A:control group;B:Iso 12 h;C:Iso 1 w.

2.2Masson三色染色结果

在注射 Iso12 h后,胶原量即明显增加(P＜0.01),此后,胶原量逐渐增加,蓝染面积扩大且颜色加深,且胶原排列紊乱,直至 1 w达到高峰。bFGF免疫组织化学染色结果显示,正常对照组中可见呈浅黄色或棕褐色阳性物质。注射Iso 12 h后,bFGF阳性物质表达明显增加,具体结果见表1及图2,3。

Fig.2 The observation results of Masson under light microscope(×400).D:control group;E:Iso12 h;F:Iso 1 w

Fig.3 The observation results of bFGF under light microscope(×400).D:control group;E:Iso 12 h;F:Iso1 w

表1 注射 Iso后 NF-κ B表达

3 讨论

近几年研究发现,FGF有几种异构体,在动脉硬化灶中起作用的主要是bFGF(basic fibroblast growth factor),bFGF可以由内皮细胞、平滑肌细胞、巨噬细胞分泌。它的作用是促进内皮细胞的游走和平滑肌细胞的增殖,不能使平滑肌细胞游走。能够促进新血管形成,修复损害的内皮细胞。FGF被认为是病灶形成促进因子,但从修复角度看它也有有利的一面。酸性成纤维细胞生长因子(acidic FGF,aFGF)又称为FGF1,是FGF家族中最早的成员之一,其对来源于中胚层和神经外胚层的细胞具有广泛的生物学效应。bFGF对实验大鼠心肌缺血再灌注损伤的心肌有保护作用。bFGF是心血管系统细胞的强烈丝裂原,对血管内皮细胞和血管平滑肌细胞均有很强的促丝裂作用。bFGF是近年来发现的在动脉粥样硬化和血管损伤过程中介导血管平滑肌增殖的细胞因子。bFGF可诱导血管内皮长入胶原基质中形成血管腔增加新生血管,从而改善局部缺血。bFGF对防止急性心肌梗死的延展和促进梗死区侧枝循环重建及心肌梗死后心功能恢复有积极作用。在狗的冠状动脉内注入栓子造成心肌梗死,bFGF冠状动脉注射治疗组能改善心肌功能,抢救心肌缺血,缩小坏死面积。组织学和血管造影等发现梗死部位有毛细血管和小动脉增加。bFGF缓释微胶囊治疗组实验兔的心肌梗死面积较对照组明显减小,且缺血区微血管计数明显增高[6-8]。新近发现bFGF具有降血压作用,是由于bFGF可以导致细胞内源性舒缓因子合成增加,导致血管舒张[9]。另有研究发现,[9-11]bFGF表达在间质纤维化的肾脏标本中明显升高,而bFGF可强有力诱导成纤维细胞增生。Strutz等在细胞培养中发现,用TGF-β1孵育6 h后,bFGF mRNA升高3.5倍,认为TGF-β1诱导bFGF合成在TGF-β1介导肾间质纤维化的发生机制中起重要作用。然而,有关bFGF在MF中的作用,目前未见报道。

本实验采用多点皮下注射Iso复制大鼠心肌坏死模型。HE染色结果显示,在注射Iso 12h后即出现点状坏死,随时间的延长缺血坏死面积明显增加,1周达到高峰,出现明显的纤维化。HE组织形态学观察结果提示,注射Iso可成功地引起大鼠心肌缺血性坏死,Masson结果亦显示,其胶原含量随Iso注射时间的延长,而逐渐增加(P＜0.01)。为探讨bFGF在大鼠缺血性MF中的作用,本文作者应用免疫组织化学及RT-PCR方法,对缺血性心肌坏死所致MF发生发展过程中,bFGF蛋白表达水平进行了动态观察,结果表明:多点皮下注射Iso引起大鼠心肌缺血性坏死后,bFGF蛋白表达随时间的延长,蛋白表达逐渐增加(P＜0.01),提示bFGF参与了大鼠心肌坏死后纤维化的发生及发展过程。

[1]张 运,徐 瑞.心肌纤维化-心力衰竭治疗的新靶标[J].中华医药杂志,2006,86(17):58.

[2]张召才,杨英珍.心肌纤维化的研究进展[J].临床心血管病杂志,2004,20(1):58.

[3]姜秀春,姜秀丽,李树青.心肌纤维化发病机制和防治的研究进展[J].医学综述,2006,12(15):931.

[4]肖厚勤,丁 国,华张建,等.环氧合酶-2抑制剂对梗阻性肾病大鼠肾组织结缔组织生长因子表达的影响[J].家用医学杂志,2005,21(3):241.

[5]高海成,于晓艳,李相军,等.环氧合酶2在心肌纤维化中的表达及意义[J].吉林大学学报,2008,34(2):233.

[6]Kawai C.From myocarditis to cardiomyopathy:Mechanisms of inflammation and cell death:Learning from the past for the future[J].Circulation,1999,99(2):1091.

[7]Schnee J M,Hsueh W A.AngiotensiⅡ,adhesion,and cardiac fibrosis[J].Cardiaovasc Res,2000,46(2):264.

[8]Kobori H,Lchihara A,Miyashits Y,et al.Local rennin-angiotensin system contributes to hyperthyroidism-induced cardial hypertrophy[J].J Endocrinol,1999,160(1):43.

[9]Hong BK,Kwon HM,ByunKH,et al.Apoptosis in dilated cardiomyopathy[J].Korean J Intern Med,2000,15(1):56.

[10]Li P F,Dietz R,Von Harsdorf R.Superoxide induces apoptosis in cardiomyocytes,but proliferation and expression of transforming growth factorbeta1 in cardiac fibroblasts[J].FEBS Lett,1999,448(2):206.

[11]王健东,潘星华.细胞凋亡调节的分子遗传机制[J].国外医学遗传学分册,1996.19(2):116.