基于Cyt b基因序列变异探讨鲱形目系统发育关系

王丹生，程远志，徐田军，王日昕

（1.辽东学院农学院，辽宁丹东 118001；2.浙江海洋学院海洋科学学院，浙江舟山 316004）

鲱形目Clupeiformes鱼类共约401种，全世界范围内均有分布，主要集中于印度洋和西太平洋，绝大多数种类栖息于热带亚热带海洋沿岸水域，少数则适应于淡水生态环境。鲱形目鱼类包括众多高经济价值种类，如鲱鱼Clupea pallasi、鲥鱼Tenualosa reevesii、斑鰶Clupanodom punchtatus、宝刀鱼Chirocentrus dorab和凤鲚Coilia mystus等[1-2]，是全球商业渔业资源的重要组成部分，2003年，鲱形目鱼类捕获量达到1 900×104t，占当年全球所有鱼类捕获量的25%(FAO,Fishery statistics 2003,http://www.fao.org/fi/statist/statist.asp)。黄鲫Setipinna taty、凤鲚隶属于鲱形目、鳀科Engraulidae，是我国长江、河口区和海洋近岸水域重要的经济鱼类[4-5]。

鲱形目划归为鲱形总目Clupeomorphe，该总目包括许多白垩纪的化石类群，而鲱形目则包括了全部的现生种类[5]。有关鲱形目的系统分类，已有较为广泛的形态学研究，在鲱形目鱼类单系起源以及与骨鳔类为姐妹群关系方面观点一致[1,6-8]。然而鲱形目科间与科内系统分类关系目前争议颇多，不同的学者由于个人观点的不同，所编分类系统存在较大差异，如国内孟庆闻等[9]所编分类系统，鲱形目分为4科：齿鲱科Denticepitidae、鲱科CIupeidae、鳀科以及宝刀鱼科Chirocentridae；而NELSON[10]则将其分为5科，隶属于孟庆闻等划定的分类系统中的鲱科鳓属Ilisha、后鳍鱼属Opisthopterus、多齿鳓属Pellona以及锯腹鳓属Pristigaster被划归为锯腹鳓科Pristigasteridae。另外，GRANDE[5]和PATTERSON等[11]依据肋骨同肋椎骨比例以及椎体同肋骨连接部位2个共同衍征将宝刀鱼科与鲱科划入鲱超科，相反，DI[12]依据形态学分析后指出，宝刀鱼科实际上与鳀科亲缘关系更近。由于形态特征容易受到环境因素的影响，不同鱼类长期在相似的生境中发展可能会使外部及骨骼形态表现出趋同性，仅利用形态特征对其分类会存在一定的偏差。分类上的混乱与争议不仅影响鲱形目鱼类系统进化研究，也会在一定程度上对养殖生产中苗种及亲本鉴定造成困难，尤其是在人工繁育过程中，物种鉴定错误有可能在繁育过程中出现杂交现象而使人工繁育归于失败[13]，因而有必要对鲱形目鱼类系统发育关系尤其是争议问题进行更为深入的研究以明确其分类关系。

物种进化的历程被DNA所忠实地记录，通过研究物种DNA序列变异信息，可追溯物种进化历史，为重建系统发育关系提供重要线索[14-15]。随着近年来DNA分子标记技术与分子系统学的快速发展，基于基因序列和分子数据对鱼类亲缘关系的分析以及种属鉴定得到广泛应用，较好地确定了许多形态上难以界定的分类关系。Cyt b基因进化速度适中，易用通用引物扩增和测序，且是线粒体基因组中唯一的结构与功能了解较为清楚的蛋白质编码基因，在鱼类分子系统学研究中应用较为广泛。区又君等[16]通过测定4种石斑鱼的Cyt b基因全长序列，并结合Genbank中7种石斑鱼同源序列进行系统发育分析，支持将鞍带石斑鱼Epinephelus lanceolatus归入石斑鱼属Epinephelus。章群等[17]利用Cyt b基因序列分析了鳜类的系统发育关系后认为长体鳜Siniperca roulei应从长体鳜属Siniperca划入到鳜属Siniperca中。庄轩等[13]通过分析石斑鱼亚科Epinephlinal 6属28种Cyt b基因片段序列，从分子系统学角度研究了其分化顺序以及亲缘关系等。但是应用线粒体序列变异研究鲱形目鱼类系统进化则鲜有报道。

本研究以我国东海舟山海域黄鲫、凤鲚为研究对象，测定了其Cyt b基因全长序列，并结合所有已发布的鲱形目鱼类Cyt b基因序列，进行分子系统学分析，探讨鲱形目鱼类系统发育关系，与形态学研究相互印证补充，以期从DNA水平为其系统进化提供依据。

1 材料与方法

1.1 样品采集与总DNA提取

黄鲫、凤鲚个体采集于浙江省舟山市沈家门码头，经形态学鉴定确认后剪取部分尾鳍用于总DNA提取。参照萨姆布鲁克等[18]方法，抽提总DNA，琼脂糖凝胶电泳检测DNA的质量和浓度，将所得DNA溶于TE溶液中-20℃保存备用。

1.2 Cyt b基因扩增

Cyt b-F:5’-GTG ACT TGA AAA ACC ACC GTT-3’和 Cyt b-R:5’-CTC CAT CTC CGG TTT ACA A－GA C-3’，用以扩增黄鲫、凤鲚的 Cyt b 基因全长[19]。PCR 扩增体系为 50 μL，包括：模板 2 μL，10×Reaction Buffer 5 μL，dNTP 各 0.2 mmol/L，上、下游引物各 0.2 μmol/L，Taq DNA 聚合酶 2 U，MgCl21.5 mmol/L。反应在Bio-Rad Mycycler PCR仪上进行。循环参数设置为：94℃预变性4 min，94℃变性30 s，55℃退火45 s，72℃延伸60 s，循环30次，最后于72℃延伸10 min。每组反应均设不含模板的空白对照。1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。

1.3 纯化回收，TA克隆与测序

扩增产物经1.5%的琼脂糖凝胶电泳后，割取目的带，利用TIANGEN琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒纯化回收目的产物。将纯化后的Cyt b的PCR产物与PMD-19T载体16℃连接过夜，转化进DH5α感受态细胞。转化子于涂有IPTG和X-gal含氨苄青霉素的LB平板上37℃培养15 h，蓝白斑筛选，挑取单克隆用M13F/M13R引物双向测序。

1.4 数据分析

用DNAstar程序包中的SeqMan进行序列拼接，获得黄鲫、凤鲚的Cyt b基因全长序列。从Genbank数据库中下载所有已发布的鲱形目鱼类Cyt b基因全长序列（表1）。利用MEGA4软件进行所有Cyt b基因序列比对，并计算变异位点数、简约信息位点数、碱基替换百分比、转换颠换比率、相对遗传距离、碱基组成与密码子使用频率。采用邻接法（NJ），以南美肺鱼Lepidosiren paradoxus为外群建立鲱形目系统发生树，自举检验1 000次评估系统树各分枝的置信度。

表1 本研究所用物种，Cyt b基因登录号Tab.1 The list of species，Cyt b gene sequences accession numbers used in this study

2 结果与讨论

2.1 Cyt b基因序列变异与碱基组成特征

经克隆测序所得黄鲫、凤鲚的Cyt b基因序列全长为1 141 bp，编码380个氨基酸，序列长度与编码氨基酸个数同已报道的绝大多数鱼类一致，如图1所示。Blast比较分析也显示两者同其他鲱形目鱼类Cyt b基因具极高的相似性[19-21]。序列提交至Genbank，获得序列号，见表1。经比对分析所有43个鲱形目鱼类Cyt b基因全长后，共检测出变异位点553个，占全部序列的48.5%，其中504个简约信息位点。总体而言，序列中转换多于颠换，Ts/Tv为2.448，明显大于2，表明所分析的Cyt b基因的突变并未达到饱和状态，其中T-C转换多于A-G，A-T和A-C的颠换多于G-T和G-C。T、C、A和G碱基的平均含量分别为28.8%、29.0%、25.2%和17.0%，A+T平均含量为54%，大于G+C的含量，同已报道的脊椎动物Cyt b基因以及整个线粒体基因组的碱基组成特征一致[22]。密码子第三位G碱基（G-3）的平均含量为9.5%，明显低于其余3种碱基含量，表现出反G偏倚，见表2。但是，不同种类Cyt b基因G-3含量存在较大个体差异性，例如沙丁鱼G-3含量为20.8%，大于A-3的含量（20.3%），而在鳄粗齿鳀中，却表现出极强的反G偏倚，G-3含量仅为1.8%。另外，一部分鲱形目鱼类，如远东拟沙丁鱼、拟沙丁鱼以及美洲拟沙丁的Cyt b基因G-3尽管表现出反G偏倚，但仍具有较高含量。在高级脊椎动物中，如鸟类和哺乳类中则有发现Cyt b基因密码子第三位表现出反A和C碱基[23-24]。目前尚不清楚这些差异是否表明各个主要动物类群适应于不同的进化道路从而定向地累积了不同的变异，值得进一步的研究。

图1 黄鲫与凤鲚Cyt b基因序列比较Fig.1 Comparison of complete sequence of Cyt b gene in S.tay and C.mystus

表2 鲱形目鱼类Cyt b基因碱基组成Tab.2 Base composition of Cyt b gene of Clupeiformes fishes

2.2 鲱形目Cyt b基因密码子分布

利用MEGA4软件分析Cyt b基因密码子分布情况，结果表明密码子分布存在偏性。使用最多的密码子为亮氨酸（CUA），平均为1.89%，其次是Cyt（GGA），平均为1.86%；使用最少的密码为丝氨酸（AGU），为0.05%。在具有4个或2个同义密码子的氨基酸中，以C碱基结尾的密码子占最多数，其次为A碱基结尾的密码子，见表3。研究发现，虽然脊椎动物mtDNA编码的蛋白基因在序列上存在很大差异，但其中绝大部分为同义替代，且主要发生在密码子第3位，该位置存在显著的核苷酸偏性选择，由于mtDNA进化速率较快，因此，同义取代可被认为是线粒体系统在进化速度较快的情况下保持自身蛋白质结构与功能稳定的一种方式[25]。另外，所有分析的Cyt b基因终止子均为不完全终止子T--，其在转录翻译过程中的多聚腺苷酸化过程中，补齐成为完整的TAA终止密码子[26]

表3 密码子平均使用频率Tab.3 Average frequence of codon usage

2.3 Cyt b基因相对遗传距离

利用MEGA4软件计算了鲱形目鱼类相对遗传距离（表4）。从表4可以看出，各物种之间的遗传距离差异较大，在0.143～0.027之间。其中齿头鲱与西鲱的遗传距离最大（0.143），同时齿头鲱与其他种类的遗传距离也较大，约为0.1，表明齿头鲱与其他物种之间亲缘关系较远，支持齿头鲱科在鲱形目中处于分化较早的地位。鲱科内黍鲱与大西洋鲱遗传距离最小（0.019），另外远东拟沙丁同大西洋鰶鱼与日本银带鲱间遗传距离也较小，分别为0.024和0.027。宝刀鱼科同鲱科、鳀科的科间遗传距离同鲱科内属间遗传距离相当，甚至低于个别属间遗传距离，并未显示出分化差异。

表4 鲱形目鱼类Cyt b基因序列遗传距离Tab.4 Genetic distance of Clupeiformes fishes Cyt b gene

图2 鲱形目NJ系统发育树Fig.2 NJ phylogenetic tree of Clupeiformes

2.4 鲱形目系统发育关系

基于Cyt b基因变异构建的NJ系统树，将43个鲱形目鱼类分为4个大支（图2）。第一支为齿鲱科，第二支由鲱科多齿鳓属和鳓属构成，宝刀鱼科并入到鲱科中聚为第三支，最后一支为鳀科鱼类组成。齿鲱科最先分化出来，为鲱形目中较为原始的类群。黄鲫、凤鲚所在的鳀科独立聚为一支，为单系发生，且黄鲫较凤鲚分化更早，支持传统形态学分类结果。在鲱形目科内分类关系层次上，孟庆闻等认为多齿鳓属和鳓属鱼类隶属于鲱科锯腹鳓亚科[9]，而NELSON则将锯腹鳓亚科归为独立的一科。NJ系统树表明鲱科并未能形成单系，黄鳍多齿鳓、鳓以及西非鳓，独立于鲱科单独聚为一支，且具较高的置信度，与LAVOUÉ等利用线粒体基因全序列构建鲱形目系统树所得结论一致，支持锯腹鳓亚科提升为锯腹鳓科[27]。在LI等[28]利用线粒体12S rRNA，16S rRNA以及RAG1与RAG2核基因进行系统发育分析，以及LAVOUÉ所进行的鲱形目系统发育分析中，宝刀鱼科宝刀鱼同鲱科任氏鲱属及银带鲱属鱼类亲缘关系最近，与鳀科关系较远，而我们的结果则表明宝刀鱼科同鲱科海鰶属和弯耙鲱属关系最近，但都支持宝刀鱼科同鲱科较近的亲缘关系，与DI[12]的形态分类学结果不一致。另外，我们在Genbank中检索到1条只具属名的任氏鲱属鱼类Cyt b基因序列，Jenkinsia sp.CL54，但在NJ系统树中，其并未与同属的宽带任氏鲱聚为一支，而是独立形成一支，提示该物种可能并非任氏鲱属鱼类。

我们的研究结果与传统分类不太相符，主要为鲱科单系地位以及宝刀鱼科同鲱科及鳀科亲缘关系，然而鲱形目鱼类众多，只有采集更多的样品，开发并采用多个分子遗传标记，基于不同的进化模型构建系统树，并结合传统形态分类结果进行比较分析，方能得出更接近真实的鲱形目物种系统进化历史。

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